难点剖析知识·巧学一、目的基因的获取基因操作的第一步，是取得人们所需要的特定基因，也就是目的基因。例如，前面提到的苏云金芽孢杆菌中的抗虫基因，还有植物的抗病(抗病毒、抗细菌)基因、种子的储藏蛋白的基因，以及人的胰岛素基因、干扰素基因等，都是目的基因。要从浩瀚的“基因海洋”中获得特定的目的基因，犹如大海捞针，是十分不易的。科学家们经过不懈地探索，想出了许多办法，概括地说，主要有两条途径：一条是从供体细胞的DNA中直接分离基因；另一条是人工合成基因。将某种生物体内的DNA全部提取出来，选用适当的限制酶，将DNA切成一定范围大小的DNA片段，然后，将这些DNA片段分别与载体连接起来，导入受体菌的群体中储存，每个受体菌都含有了一段不同的DNA片段。这个群体包含了这种生物的所有基因，叫做这种生物的基因组文库。如果用某种生物发育的某个时期的mRNA反转录产生的多种互补DNA（也叫cDNA）片段，与载体连接后储存在一个受体菌群体就叫做这种生物的cDNA文库。知识拓展直接分离基因最常用的方法是“鸟枪法”，又叫“散弹射击法”。这种方法犹如用猎枪发射的散弹打鸟，无论哪一颗弹粒击中目标，都能把鸟打下来。鸟枪法的具体做法是：用限制酶将供体细胞中的DNA切成许多片段，将这些片段分别载入运载体，然后通过运载体分别转入不同的受体细胞，让供体细胞所提供的DNA(外源DNA)的所有片段分别在各个受体细胞中大量复制(在遗传学中叫做扩增)，从中找出含有目的基因的细胞，再用一定的方法把带有目的基因的DNA片段分离出来。如许多抗虫、抗病毒的基因都可以用上述方法获得。用“鸟枪法”获取目的基因的缺点是工作量大，具有一定的盲目性。又由于真核细胞的基因含有不表达的DNA片段，不能直接用于基因的扩增和表达，因此，在获取真核细胞中的目的基因时，一般是用人工合成基因的方法。20世纪80年代以后，随着DNA核苷酸序列分析技术的发展，人们已经可以通过DNA序列自动测序仪对提取出来的基因进行核苷酸序列分析，并且通过一种扩增DNA的新技术(也叫PCR技术)，使目的基因片段在短时间内成百万倍地扩增。上述新技术的出现大大简化了基因工程的操作技术。难点剖析PCR扩增是获取目的基因的一种非常有用的方法，也是进行分子鉴定和检测的一种很灵敏的方法。PCR反应包括以下几个主要过程：第一步：将反应体系（包括双链模板、引物、耐高温的DNA聚合酶、四种脱氧核糖核苷酸以及酶促反应所需的离子等）加热至90～95℃，使双链DNA模板两条链之间的氢键打开，变成单链DNA，作为互补链聚合反应的模板。第二步：将反应体系降温至55～60℃，使两种引物分别与模板DNA链3′端的互补序列互补配对，这个过程称为复性。第三步：将反应体系升温至70～75℃，在耐高温的DNA聚合酶催化作用下，将与模板互补的单个核苷酸加到引物所提供的3—OH上，使DNA链延伸，产生一条与模板链互补的DNA链。上述三步反应完成后，一个DNA分子就变成了两个DNA分子，随着重复次数的增多，DNA分子就以2n的形式增加。PCR的反应过程都是在PCR扩增仪中完成的。知识拓展目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。必须构建上述元件的主要理由：（1）生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达。（2）通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录。（3）目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记。（4）为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控元件，如增强子等。（5）有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。二、基因表达载体的构建将目的基因与运载体结合的过程，实际上是不同来源的DNA重新组合的过程。如果以质粒作为运载体，首先要用一定的限制酶切割质粒，使质粒出现一个切口，露出黏性末端然后用同一种限制酶切断目的基因，使其产生相同的黏性末端。将切下的目的基因的片段插入到质粒的切口处，再加入适量的DNA连接酶，质粒的黏性末端与目的基因D...
