全内反射荧光显微镜发展历史优势应用分型及结构基本原理发展与展望细胞中有些物质，如叶绿素等，受紫外线细胞中有些物质，如叶绿素等，受紫外线照射后可发荧光；另有一些物质本身虽不能发荧光，照射后可发荧光；另有一些物质本身虽不能发荧光，但如果用荧光染料或荧光抗体染色后，经紫外线照但如果用荧光染料或荧光抗体染色后，经紫外线照射亦可发荧光，荧光显微镜就是对这类物质进行定射亦可发荧光，荧光显微镜就是对这类物质进行定性和定量研究的工具之一。性和定量研究的工具之一。发展历史荧光显微镜的概念荧光显微镜的概念在细胞生物学方面，传统光学显微镜始终不能解决生物样本显微中的几个重要问题：1.显微图像的信噪比不高；2.光源对生物样本照射的损伤；3.光学衍射所致的分辨极限（R≥0.61λ/nsinθ）：传统的光学显微镜由于受到光瞳远场衍射效应的影响,存在分辨极限,瑞利将之归纳为R≥0.61λ/nsin(u/2),其中R为分辨力,λ为成像光波波长,nsin(u/2)为物透镜的数值孔径,即NA值，u为孔径角,因此光学显微镜空间分辨极限～250nm。发展历史全内反射荧光显微术的发展历程全内反射荧光显微术的发展历程近年来人们开发出了一系列光学显微近年来人们开发出了一系列光学显微镜。其中，镜。其中，全内反射荧光显微术全内反射荧光显微术(Totalinternal(Totalinternalreflectionfluorescencemicroscopy,reflectionfluorescencemicroscopy,TIRFMTIRFM))是是近年来新兴的一种光学成像技术。近年来新兴的一种光学成像技术。全内反射荧光显微术的发展历程全内反射荧光显微术的发展历程Hirschfield完成了第一个全内反射荧光实验1965年Axelrod等生物物理学家对TRIFM技术及基本原理进行描述，并探索了其生物应用。20世纪8080年代早期年代早期20世纪90年代新型物镜透镜、聚光镜和超灵敏探测器的出现，使TRIFM技术得到充分发展。1995年Yanagida小组用TIRFM技术首次在液体溶液中得到了荧光标记的单个蛋白质分子的成像。该项技术已经应用到许多单分子的研究中这是首次尝试用全内反射荧光这是首次尝试用全内反射荧光法测液体中的单个分子的荧光。法测液体中的单个分子的荧光。将全反射理论与生物细胞的荧将全反射理论与生物细胞的荧光成像技术相结合是一种全新光成像技术相结合是一种全新的突破。的突破。肌球蛋白酶活性测量，肌收缩力的产生，肌球蛋白酶活性测量，肌收缩力的产生，荧光标记驱动蛋白动态研究。荧光标记驱动蛋白动态研究。1996年Moerner小组又用这项技术实现了限制在丙烯酰胺胶体的纳米孔中的单分子的三维成像。至今基本原理全内反射荧光显微镜的基本设计思路全内反射荧光显微镜的基本原理全内反射荧光显微术是利用全内反射产生的消逝波激发样品,从而使样品表面数百纳米厚的薄层内的荧光团受到激发,荧光成像的信噪比大大提高。可以看到样品表面，单分子的活动情况。这种方法的成像装置简单，极易和其它成像技术、探测技术相结合，目前已成功的实现100nm甚至更低的空间分辨率。基本原理全内反射荧光显微镜的基本设计思路全内反射荧光显微镜的基本原理荧光激发原理荧光捕捉原理snell定律:n1sinθ1=n2sinθ2当n1大于n2时，全反射就可能发生:θ2=90°θc=sin-1(n2/n1)即所有的入射光线全部反射出来,称为全内反射荧光激发原理沿着入射面上的介质边界传播在平行界面方向以平行波场方式传播在垂直界面方向则是呈指数衰减。隐失波的强度-深度图荧光激发原理非均匀波透射强度和浸透深度公式透射强度和浸透深度公式T12（θi）-分界面处的透射强度d12-渗透深度θi-入射角λ-入射光波长对于可见光波长380～780nm而言，浸透深度为～100nm。荧光激发原理箭头表示激光的方向，激光被全反射，同时产生在z方向成指数衰减的隐失波。黄色小圆点表示被隐失波激发的荧光分子，白色小圆点表示未被激发的荧光分子。荧光捕捉原理CCD相机CCD相机的高灵敏度高灵敏度特点使全内反射荧光显微镜利用消逝波照射样品并使其成像成为可能，也成就了其高信噪比。CCD相机的快速成像快速成像特点提高了其时间分辨率，使得观察单分子的运动、细胞物质的分泌、蛋白质的相互作用成为可能并成为这方面的优势观察仪器。目前使用...
