自发性癫痫大鼠脑内海马Ⅲ型电压门控性钠通道N亚型表达上调VIP专享VIP免费

第1卷第4期2006年11月291中国科技论文在线SCIENCEPAPERONLINE自发性癫痫大鼠脑内海马Ⅲ型电压门控性钠通道N亚型表达上调于娜，郭凤，杜娃，姚维凡，蔡际群（中国医科大学，药学院药物毒理学教研室，沈阳110001）摘要：[目的]对照研究自发性癫痫大鼠（SER）和正常Wistar大鼠（WTC）脑内Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型钠通道α亚基mRNAs与蛋白表达情况。[方法]提取枕叶皮质、齿状回及海马CA1和CA3区组织总RNA，应用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）及建立限制性内切酶图谱检测Ⅰ、AⅡ、NⅡ、AⅢ和NⅢ的表达，应用免疫荧光定位与表达α3亚基ⅢN蛋白。[结果]SER枕叶皮质、齿状回及海马CA1和CA3区总钠通道的表达略高于WTC，但均无显著差异（P>0.05），SERⅢ型钠通道在海马的表达高于WTC（P<0.01），酶切图谱显示NⅢ型钠通道表达水平有明显上调。[结论]SER脑内海马Ⅲ型电压门控性钠通道N亚型表达上调。关键词：钠通道；mRNA；RT-PCR；限制性内切图谱检测；自发性癫痫大鼠中图分类号：R96文献标识码：A文章编号：1673–7180(2006)04–0291–5自发性癫痫大鼠（spontaneouslyepilepticrat，SER）为双基因突变大鼠，由tremor（tm）[1]大鼠杂合子（tm/+）和zitter（zi）[2]大鼠纯合子（zi/zi）交配得到[3]。生后8周，SER出现自发性的癫痫大发作和小发作，其对于抗癫痫药物的反应同癫痫患者类似[4]，是研究遗传性癫痫的理想动物模型。大鼠脑内存在着几种不同的钠通道α亚基cDNAs，由至少5种不同的基因编码：NaChⅠ、NaChⅡ、NaChⅢ、NaCh-G和NaCh6[5,6]。其中NaChⅡ、NaChⅢ基因还存在2种亚型，称为A（成熟型）和N（新生儿型）[7]。由于神经元兴奋性形成过程中电压依赖性钠通道起着重要作用，而且是一些抗癫痫药物作用的主要位点，因此我们采用RT-PCR及建立限制性内切酶图谱方法和免疫荧光技术研究SER和WTC脑内皮质、齿状回及海马CA1和CA3区Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型钠通道及其亚型mRNA和蛋白的表达情况，为寻找与钠通道有关的癫痫相关基因及癫痫的基因治疗提供理论依据。1材料和方法1.1实验动物SER和WTC各5只，体重150克左右，雌雄不限，均由中国医科大学实验动物部提供。1.2标本及总RNA制备大鼠在麻醉状态下断头，迅速取脑，液氮速冻，用冰冻切片机切成厚度达400μm的冠状切片。在双目显微镜下从脑切片的四个不同部位进行针孔取样（直径为1.4mm）：大脑枕部皮质、齿状回及海马CA1和CA3椎体细胞层。将标本置于-80℃备用。用TRIzol（GIBCOBRL）提取总RNA（按厂家说明操作），电泳检测完整性，测定浓度后-70℃保存。1.3逆转录第一链cDNA按RT-PCR试剂盒（大连宝生物）说明书，用Oligo(dT)15-18引物合成。反应条件：42℃30min、995min℃，逆转录产物4℃保存。除RNA样本外加所有试剂的反应管作为空白对照，以等量的DEPC水代替RNA样本。1.4聚合酶链反应（PCR）PCR1，以β-actin（上游5′-ATCATGTTTGAGACCTTCAACA-3′，下游5′-CATCTCTTGGTCGAAGTCCA-3′）为内参照(308bp)，靠近大鼠脑钠通道序列的5´端626个碱基的片段用一组引物进行扩增，该组引物对大鼠5个序列（Ⅰ、AⅡ和N、AⅢ和N）均完全符合。引物序列为：引物15′-CATTCCTCCAGAGATGGTGTC-3′，引物25′-TATTCCTCAGGTTGCCCATGAA-3′。为了提高退火的特异性，退火温度采取渐降方式（touch-down第1卷第4期2006年11月292自发性癫痫大鼠脑内海马Ⅲ型电压门控性钠通道N亚型表达上调PCR），在16个循环过程中从68~60℃每个循环降低0.5℃，最后14个循环退火温度维持在60℃。PCR2，除不加入β-actin引物外，其余条件与PCR1相同。PCR3，以GAPDH（上游5′-AATGCATCCTGCACCACCAA-3′，下游5′-GTAGCCATATTCATTGTCATA-3′）为内参照（515bp），另设计一组引物专门分析Ⅲ型钠通道mRNA的表达，分别为：引物35′-AAGTCGGAATCGGAAGACAGTGT-3′，引物45′-AGGATACTGGCTATGCTCATGGATC-3′（415bp）。30个循环的退火温度恒定于58℃。PCR4，特异性用于区分Ⅲ型钠通道的两种亚型（引物55′-TGGAACTGGCTGGATTTCAG-3′，引物65′-GAAGTAGGAAGTAGTGTTGG-3′），除不加入GAPDH引物外，其余条件与PCR3相同。所有引物均为上海生工生物工程公司合成。1.5PCR产物电泳及定量分析1.5.1电泳分析取PCR1和3产物进行...