间接免疫荧光实验间接免疫荧光实验实验原理实验原理固定在载片上的灵长类肝组织和固定在载片上的灵长类肝组织和HEp-2HEp-2细细胞与适当稀释的待检血清反应后胞与适当稀释的待检血清反应后,,如果待如果待检血清中有检血清中有ANA,ANA,就会与细胞核成分特异结就会与细胞核成分特异结合合,,加入加入FITCFITC标记的的羊抗人标记的的羊抗人IgGIgG抗体又抗体又可与可与ANAANA结合结合,,在荧光显微镜下可见细胞在荧光显微镜下可见细胞核部位呈现荧光。核部位呈现荧光。试剂与器材试剂与器材1.1.抗原片抗原片2.2.荧光标记的二抗荧光标记的二抗3.PBS-Tween3.PBS-Tween缓冲液缓冲液4.4.阴、阳性参考血清阴、阳性参考血清5.5.封片介质封片介质::磷酸盐缓冲甘油磷酸盐缓冲甘油6.6.盖玻片盖玻片7.7.器材器材::荧光显微镜、摇床、脱色缸、吸荧光显微镜、摇床、脱色缸、吸管、试管等管、试管等生物薄片生物薄片马赛克：将包被有不同基质的生物薄片固定在一个载片反应区中，可同时检测多种抗不同组织或病原体的抗体。滴定平板技术：滴定平板技术：使实验操作标准化使实验操作标准化将标本或试剂滴加到加样板反应区上，然后把生物薄片载片盖在加样板的凹槽里，所有生物薄片均与液滴接触，反应同时开始.系统的几何结构决定了液滴的位置和高度.荧光二抗荧光二抗荧光素荧光素发射的发射的荧光色荧光色激发波长激发波长（（nmnm））发射波长发射波长（（nmnm））异硫氰酸荧光素异硫氰酸荧光素（（FITCFITC））绿绿495495528528荧光素及其激发波长和发射波长荧光显微镜：荧光显微镜：落射式荧光显微镜①不需要额外的聚光镜②可产生高对比度的暗视野③同时进行明视野、暗视野的抗原基质定位④可观察两种不同的荧光⑤可改变荧光的强度IIFIIF操作步骤操作步骤１．１．准备准备：：检查加样板是否反应区亲水而周边疏水。从试剂检查加样板是否反应区亲水而周边疏水。从试剂盒中取出载片，等平衡到室温时方可打开包装。注意不要盒中取出载片，等平衡到室温时方可打开包装。注意不要触及生物薄片。用笔编号、标记。触及生物薄片。用笔编号、标记。２．２．稀释稀释：：用磷酸盐缓冲液用磷酸盐缓冲液1:1001:100稀释血清。注意：阳性和稀释血清。注意：阳性和阴性对照不需稀释，使用前要混匀阴性对照不需稀释，使用前要混匀３．３．加样加样：：将加样板放在泡沫板上，按顺序分别滴加将加样板放在泡沫板上，按顺序分别滴加25ul25ul稀释后的血清至加样板的反应区中，避免产生气泡。滴加稀释后的血清至加样板的反应区中，避免产生气泡。滴加完所有待测标本后才开始温育。完所有待测标本后才开始温育。４．４．第一次温育第一次温育：：将载片覆有生物薄片的一面朝下，盖在加将载片覆有生物薄片的一面朝下，盖在加样板的凹槽里，反应立即开始。确保每一个标本均与生物样板的凹槽里，反应立即开始。确保每一个标本均与生物薄片接触，且标本间互不接触。室温温育薄片接触，且标本间互不接触。室温温育3030分钟。分钟。５．５．清洗清洗：：用磷酸盐缓冲液流水冲洗载片用磷酸盐缓冲液流水冲洗载片11秒钟（注意水流秒钟（注意水流不要太急，不要直接对着基质冲），然后立即将其浸入装不要太急，不要直接对着基质冲），然后立即将其浸入装有磷酸盐缓冲液的脱色缸中浸洗有磷酸盐缓冲液的脱色缸中浸洗55分钟。分钟。６．６．加样加样：滴加：滴加20ulFITC20ulFITC标记的羊抗人标记的羊抗人IgGIgG至洁净加样板至洁净加样板的反应区中，完全加完所有的二抗后，方可继续温育。注的反应区中，完全加完所有的二抗后，方可继续温育。注意：标记的意：标记的IgGIgG使用前需混匀。使用前需混匀。７．７．第二次温育第二次温育：：从磷酸盐缓冲液中取出一张载片，用吸水从磷酸盐缓冲液中取出一张载片，用吸水纸擦一下背面和边缘后，立即将载片覆有生物薄片的一面纸擦一下背面和边缘后，立即将载片覆有生物薄片的一面朝下，盖在加样板的凹槽里。朝下，盖在加样板的凹槽里。注意：为防止破坏基质，不注意：为防止破坏基质，不要擦拭反应区的间隙要擦拭反应区的间隙。检查生物薄片是否与液滴接触良好，。检查生物薄片是否...
