血浆循环icroRNA提取检测及其在冠心病的表达[精品]VIP专享VIP免费

血浆循环MicroRNA提取检测及其在冠心病的表达郑志伟劳海燕余细勇林秋雄朱杰宁王玲孙硕陈纪言钟诗龙△广东省人民医院医学研究中心，广东省心血管病研究所讲述目录背景背景方法方法检测检测探讨探讨简述血浆循环miRNA提取检测的方法采用前述建立的方法，在25例冠心病患者和30例健康对照中检测miRNA的表达情况。在细胞实验进一步探讨miRNA的作用机制研究背景MicroRNA是生物体内长度约为20－23个核苷酸的非编码小RNA，通过与靶mRNA的互补配对而在转录后水平上对基因的表达进行调控。最近研究发现血液循环中也存在miRNA，有希望作为疾病无创诊断或者疾病预后的生物标志物。SolexaWholeGenomeSequencingmiRNAs(21-23nt)weremostabundantsequencesinserumRNAsChenetal.2008CellRes.miRNA差异？疾病预后，转归血浆循环miRNA的表达–预测?生物标记物？我们的设想我们的研究工作研究血浆中存在的循环miRNA，建立其提取检测的方法，并且检测血浆miRNA在冠心病人中的表达情况，寻找疾病发生发展或者影响预后的生物标记物。血浆miRNA提取检测基本流程血浆循环miRNA提取方法血浆miRNA的提取第四步晾干，加无RNAase水进行溶解，检测浓度，保存第一步ProteinK消化，TrizolLS和氯仿对血浆进行提取第三步离心，取得RNA沉淀，70%乙醇洗涤第二步异丙醇和核酸共沉淀剂对前述水相进行沉淀血浆循环miRNA的检测原理实验结果二、miRNA提取方法学的考察（一）1、采用外源合成的cel-miRNA-39检验提取方法的提取效率：2、has-miR-16的累加实验采用加入外源合成的has-miR-16mimics，比较提取方法的有效性。二、miRNA提取方法学的考察（二）内源BBmimicsAA0510152025303512CT值加hsa-miR-1640pmol正常提取三、检测miRNA在两组人群中的表达差异Coronaryarteryheartdisease（CHD）25例Healthycontron30例3.1、研究的一般资料—年龄3.2、研究的一般资料—性别228233024681012141618202224262830男女healthycontroncoronaryarteryheartdiseaseP=0.1553.3、血浆循环has-miR-126的表达量3.4、血浆循环has-miR-16的表达量四、进一步的机制探讨1、培养人心肌细胞AC16，进行miR-126inhibitor的转染，Q-PCR检测miR-126和血管内皮生长因子(VEGF)的表达。2、Tunel检测心肌细胞凋亡情况。00.511.522.533.544.55has-miR-126inhibitorNCrelativeexepresshas-miR-126VEGF四、Q-PCR检测VEGF的表达结果VEGF有促进血管生成的作用，在冠心病患者中miR-126的表达下降，可能跟VEGF调节血管生成有关，其具体的机制还有待进一步的研究。三、TUNEL凋亡结果分析（一）图1AC16细胞-正常A：细胞形态；B：Tunel；C:DAPI染色（核定位）；D：B和C的重叠图三、TUNEL凋亡结果分析（二）图3AC16细胞转染mir-126inhibitorA：细胞形态；B：Tunel；C:DAPI染色（核定位）；D：B和C的重叠图四、本文结论：结论：采用TrizolLS提取血浆总RNA的方法可行，miRNA检测方法的特异性和灵敏性较好，血浆hsa-miR-126表达的差异可能在冠心病的发展过程中发挥调节作用，其作用机制可能与影响血管生成和心肌保护作用有关，具体的机制还有待于进一步的研究。感谢各位关心和指导实验的老师，感谢广东省人民医院提供的的实验平台和临床标本收集的支持！谢谢各位专家和老师的指导！致谢