第21卷第2期2006年4月北京农学院学报JOURNALOFBEIJINGAGRICULTURALCOLLEGEVol.21,No.2Apr.,2006收稿日期:2005-09-29;修订日期:2006-03-07基金项目:北京市教委资助项目(KW20051002006)作者简介:路苹,女,硕士,高级实验师,研究方向:植物生理生化蛋白质测定方法评价路苹,于同泉,王淑英,王建立,杨柳(农业应用新技术北京市重点实验室/北京农学院生物技术系,北京102206)摘要:蛋白质测定在生命科学研究领域中有着重要意义,论述了蛋白质测定的主要方法,评价了各种蛋白质测定方法的技术特点和适用范围。关键词:蛋白质;测定方法;评价中图分类号:Q503文献标识码:A文章编号:1002-3186(2006)02-0065-05AReviewonDeterminationofProteinLUPing,YUTong-quan,WANGShu-ying,WANGJian-li,YANGLiu(NewTechnologicalLaboratoryinAgricultureApplicationinBeijing/DepartmentofBiologiealTechnology,BeijingAgriculturalCollege,Beijing102206,China)Abstract:Proteindeterminationisimportantinlifescienceresearch.Thispaperreviewedthemethodsusedindeterminationofprotein.Theadvantageandsuitabilityamongthemethodswereevaluated.Keywords:protein;determinationmethods;review蛋白质是由A-氨基酸以酰胺键(肽键)相结合形成的结构极其复杂的高分子化合物,是生物体中的主要含氮物质。蛋白质与细胞结构、酶、激素、病毒、免疫、物质转运和遗传等密切相关,蛋白质的定量测定是生物化学和其他生物科学、食品检验、临床检验、疾病诊断和质量检验中最重要的工作。蛋白质测定方法一般可分为间接方法和直接方法。间接方法是通过测定样品中蛋白质的含氮量进行推算蛋白质含量的方法。直接方法则是根据蛋白质的物理和化学性质,直接测定蛋白质含量的方法。多年来,利用蛋白质的主要性质(如含氮量、肽键、折射率等)和利用蛋白质含有的特定氨基酸残基(如芳香基、酸性基、碱性基等),测定蛋白质的方法不断发展,主要有凯氏定氮法(国际经典测定方法)、分光光度法、电化学法、滴定法、高压液相色谱法、电泳法、免疫法等。了解各种蛋白质测定方法的原理和技术特点,对在实际工作中选择适宜的分析方法具有重要的指导意义。1凯氏定氮法111凯氏定氮法的原理凯氏定氮法测定蛋白质分为样品消化、蒸馏和吸收、滴定3个过程。在催化剂作用下,试样用浓硫酸消煮破坏有机物,使其中的蛋白质氮及其他有机氮转化为氨态氮,然后与硫酸结合生成硫酸铵。加入强碱进行蒸馏使氨逸出,用硼酸吸收后,再用酸滴定,测出含氮量,将结果乘以换算系数,计算出粗蛋白质含量[1-3]。112凯氏定氮法的特点测定蛋白质最常用的方法是凯氏定氮法,它是测定试样中总有机氮最准确和最简单的方法之一,被国际国内作为法定的标准检验方法。该法关键环节有浓硫酸用量、催化剂选择、消化时间、氢氧化钠用量和硼酸吸收液指示剂选择等。样品在消化时加入浓硫酸的量必须过量,一是脱水作用,将样品中有机物脱水然后碳化成C;二是66北京农学院学报第21卷氧化作用,浓硫酸和硫酸钾、硫酸铜一同加热使温度达到400e以上,碳还原硫酸生成SO2,而碳本身被氧化成CO2;三是分解作用,将蛋白质分解,SO2还原N生成NH+4,本身被氧化成SO3;四是吸收作用,生成的NH+4与浓硫酸反应生成(NH4)2SO4;五是生成的(NH4)2SO4保存在浓硫酸溶液中不至于损失[2,4]。样品消化过程要加入催化剂,加入硫酸钾能够提高分解时溶液的温度,使溶液沸点由290e提高到400e,加入硫酸铜、氧化汞和硒粉则能促进试样的分解,缩短消化时间。有试验证明,用硒粉作催化剂可加快消化速率,缩短试样消化时间,其测定结果与硫酸铜作为催化剂的传统方法相当吻合[5],但硒粉使用量过多或与硫酸作用时间过久会使铵态氮成为分子氮而损失[6]。虽然加入氧化汞能够节省消化时间,但由于污染较重,多用于仲裁检验[7]。目前包括国标方法大多加入硫酸钾和硫酸铜混合催化剂,但众多文献中二者用量的比例有所不同,硫酸钾B硫酸铜比例主要有15B1、10B1、10B0.9和9B1等[1-2,7-8],国标方法采用10B1比例,硫酸铜用量是影响消化时间的主要因素[9]。样品消化过程中,消化液经过一系列改变最终转变为绿色透明状态,这种过程是碳化的有机物完全被氧化的变化,但决不表示样品中...
