PCR扩增产物的分析VIP免费

PCR扩增产物的分析•Gelelectrophoresis•Restrictionendonuclease•Molecularhybridization•NucleicacidsequencePCR扩增产物的电泳分析琼脂糖凝胶电泳常用于临床检测（定性）聚丙烯酰胺凝胶电泳分离效果比琼脂糖好，条带比较集中可用于科研及检测分析琼脂糖凝胶电泳•琼脂糖凝胶电泳是一种非常简便、快速、最常用的分离纯化和鉴定核酸的方法•琼脂糖是从海藻中提取的一种线状高聚物•根据琼溶解温度，把琼脂糖分为一般琼脂糖和低熔点琼脂糖•低熔点琼脂糖熔点为62～65℃，溶解后在37℃下维持液体状态约数小时，主要用于DNA片段的回收，质粒与外源性DNA的快速连接等凝胶浓度选择琼脂糖浓度(%)线型DNA分子的分离范围(Kb)0.35～600.61～200.70.8～100.90.5～71.20.9～61.50.2～312.00.1～2琼脂糖凝胶的浓度与DNA分离范围电泳缓冲液•常用三种缓冲液–Tris-硼酸（TBE）–Tris-乙酸（TAE）–Tris-磷酸（TPE）•TBE与TPE：缓冲容量高，DNA分离效果好，但TPE在DNA片段回收时含磷酸盐浓度高，容易使DNA沉淀•TAE：缓冲容量低，但价格较便宜，因而推荐选用TAE。缓冲液中的EDTA可螯合二价阳离子，从而抑制DNA酶的活性，防止PCR扩增产物降解10×TBE缓冲液的配制•配方–Tris108克–EDTA9.3克–硼酸55克–H2O至1000ml•pH应为8.0～8.2•临用时用水稀至0.5×TBE（20倍稀释）核酸电泳的指示剂•指示剂：–溴酚兰–二甲苯青•溴酚兰：在碱性液体中呈紫兰色•电泳中，溴酚兰的迁移率与双链线性DNA片段琼脂糖凝胶浓度0.6%1%1.4%2%迁移率1Kb0.6Kb0.2Kb0.15Kb核酸电泳的指示剂•二甲苯青：水溶液呈兰色，•电泳时，其迁移速率与双链线性DNA大致相当琼脂糖凝胶浓度1%1.4%迁移率2Kb1.6Kb载样缓冲液•指示剂一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成载样缓冲液•作用：–①增加样品密度，使其比重增加，以确保DNA均匀沉入加样孔内–②在电泳中形成肉眼可见的指示带，可预测核酸电泳的速度和位置–③使样品呈色，使加样操作更方便核酸电泳的染色剂•最常用的染色剂–溴化乙锭–银染色核酸电泳的染色剂•溴化乙锭（ethidiumbromide，EB）–是一种荧光染料，EB分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出红色荧光–可在凝胶电泳液中加入终浓度为0.5ug/ml的EB，有时亦可在电泳后，将凝胶浸入该浓度的溶液中染色10～15min–琼脂糖凝胶EB染色，肉眼可见核酸电泳带，其DNA量一般>5ng–溴化乙锭太多，凝胶染色过深，核酸电泳带看不清时，可将凝胶放入蒸馏水浸泡30min后再观察核酸电泳的染色剂•银染色：银染色液中的银离子(Ag+)可与核酸形成稳定的复合物，然后用还原剂如甲醛使Ag+还原成银颗粒，可把核酸电泳带染色黑褐色•主要用于聚丙烯酰胺凝胶电泳染色，也用于琼脂糖凝胶染色•灵敏度比EB高200倍，但银染色后，DNA不宜回收电泳•电泳装置–电泳仪–电泳槽–灌胶模具等电泳仪•普通电泳仪•高压电泳仪电泳槽•水平平板•垂直平板电泳方法•用蒸馏水将电泳槽和梳子冲洗干净，放在水平桌面上，并架好梳子•根据核酸分子量的大小配制不同浓度的琼脂糖凝胶，一般200～400bp的DNA片段（可配制1.2～1.7%）电泳方法配制琼脂糖凝胶及倒胶•0.5×TBE电泳缓冲液100ml于三角烧瓶中，称取一定量的琼脂糖粉放入后沸水锅或微波炉内加热熔化，冷却至60(℃需要时可加入EB)，倒入电泳槽中，待凝固•向电泳槽中倒入0.5×TBE，其量以没过胶面2mm为宜，小心移去梳子（如样品孔内有气泡，应除去）电泳方法上样与通电•在DNA样品中加入0.2体积的载样缓冲液，混匀后，加入样品孔内•接通电源，一般红色为正极黑色为负极，切记DNA样品由负极往正极泳动（靠近加样孔的一端为负），电压为1—5V/cm（长度以两个电极之间的距离计算）•根据指示剂泳动的位置，判断是否终止电泳，一般200～400bp的PCR产物50V电压，电泳20～40min电泳方法结果观察•紫外仪上观察电泳带及其位置•并与核酸分子量标准比较被扩增产物的大小聚丙烯酰胺凝胶电泳•适宜分离鉴定低分子量蛋白质、小于1Kb的DNA片段和DNA序列分析•其装载的样品量大，回收DNA纯度高，长度仅相差0.2%（即500bp中的1bp）的核苷酸分子即能分离聚丙烯酰胺凝胶•由丙烯酰胺单体，在催化...