sscp实验操作VIP专享VIP免费

PCR-单链构象多态性(PCR-single-strandconformationpolymorphism，SSCP)单链DNA片段呈复杂的空间折叠构象，这种立体结构主要是由其内部碱基配对、氢键等分子内相互作用力来维持的，当有一个碱基发生改变时，会或多或少地影响其空间构象，使构象发生改变，空间构象有差异的单链DNA分子在聚丙烯酰胺凝胶中受排阻大小不同。因此，通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，可以非常敏锐地将构象上有差异的分子分离开。该方法即为单链构象多态性(Single-StrandConformationPolymorphism，SSCP)分析。基本原理将SSCP用于检查PCR扩增产物的基因突变，建立PCR-SSCP技术。基本过程：①PCR扩增靶DNA;②将特异的PCR扩增产物变性，而后快速复性，使之成为具有一定空间结构的单链DNA分子；③将适量的单链DNA进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳;④最后通过放射性自显影、银染或溴化乙锭显色分析结果。若发现单链DNA带迁移率与正常对照的相比发生改变，就可以判定该链构象发生改变，进而推断该DNA片段中有碱基突变。PCR-SSCP基本过程SSCP的应用进行人类DNA多态性分析，大量地用于检测和肿瘤发生有关的基因突变。如检测星形细胞瘤、脑瘤、小细胞肺癌、胃癌、肠癌等肿瘤中的p53基因的突变、肺癌的ras基因突变等。用于检测引起人类遗传性疾病的研究上。如在囊性纤维化中起作用的CFTR基因、神经纤维瘤1型基因、家族性结肠息肉基因的研究中。用于病毒的分型、监测PCR实验中的污染情况、以及病原体传播途径的研究中。Yap用巢式PCR对来自不同国家和地区的HBV标品进行了检测，并对扩增产物进行了SSCP分析，发现每个标本的SSCP图谱完全不同，不仅证明了HBVDNA具有地区性变异，而且排除了交叉性污染的可能性。PCR-SSCP的实验操作1.在进行SSCP前首先要通过PCR扩增出特异性好的产物(琼脂糖电泳不能有过强的拖尾和引物二聚体)。2.制备聚丙烯酰胺凝胶(PAG)（1）电泳槽玻璃板的处理：用洗涤剂清洗玻璃板，自来水反复冲净洗涤剂，双蒸水冲洗，95％乙醇擦拭，通风橱自然晾干。两块玻璃对齐，底部和两侧用橡胶条封好，用1%琼脂糖胶封底，固定在垂直电泳槽上。（2）制胶：按照被分离DNA片段的大小、含量及玻璃板、衬条的大小决定凝胶的浓度与体积，一般来讲使用5％～8％的凝胶较为合适。PCR-SSCP的实验操作在小于1Kb长度的情况下，DNA片段长度与丙烯酰胺的浓度选择如下:DNA片段长度(核苷酸数)丙烯酰胺(%)1Kb～700b3.5700b～500b5500b～200b8200b10-12PCR-SSCP的实验操作PAGE的制备：成分：浓度：8%10%40%丙烯酰胺8ml10mlddH2O26ml24ml甘油4ml4ml10×TBE2ml2mlTEMED40ul40ul10%AP600ul600ulPCR-SSCP的实验操作10×TBE：Tris108g，硼酸55g，0.5mol/LEDTA（pH8.0）40ml，定容至1000ml，高压灭菌，4℃贮存。40%丙烯酰胺贮备液（交联度49:1）：39.2g丙烯酰胺，0.8g甲叉双丙烯酰胺，溶解后定容至100ml，过滤，避光4℃贮存。10％过硫酸铵：过硫酸铵0.1g溶于1ml蒸馏水，4℃贮存数周。2×上样缓冲液：甲酰胺9.5g，0.5mol/LEDTA0.4ml，二甲苯蓝FF5mg,溴酚兰5mg，加水溶解，定容到10ml。试剂配制：PCR-SSCP的实验操作（3）按上表配制合适浓度的胶液，轻轻摇匀。用1ml移液器吸取胶液，缓慢注入两玻璃板间的空隙中，直至灌满模具顶部，立即插入相应的点样梳，（小心勿使梳齿下带进气泡，并且不要将梳齿全部插入胶内，留约2mm梳齿于玻璃板上端，以免拔梳时把胶孔拔断）。由于凝胶在聚合过程中有回缩，所以应小心添加些胶液于梳子处，水平放置，室温聚合1hr。小心取出点样梳，在电泳槽内灌入1×TBE电泳缓冲液，用槽内的缓冲液反复冲洗点样孔，以去除可能存在的未聚合的聚丙烯酸胺和气泡。样品上胶前预电泳约30分钟。PCR-SSCP的实验操作3.扩增产物的处理：取0.4-1.2μlPCR扩增产物，加入15μl2×上样缓冲液中，混匀。100ºC变性10min，立即冰浴骤冷2分钟以上。然后将10μl混合物上样，以微量加样器上样。上样时要注意不要有气泡冲散样品，而且速度要快，时间长了样品易于扩散。PCR-SSCP的实验操作4.电泳：根据扩增片段的大小及电泳槽和凝胶的大小，决定电泳的电压及电泳时间。通常室温下以l～5V／cm电泳。5.剥胶：电泳结束后，回收电泳缓冲液，...