氨基酸含量的测定-茚三酮比色法VIP免费

实验九氨基酸含量的测定（茚三酮比色法）1.实验原理凡含有自由氨基的化合物，如蛋白质、多肽、氨基酸（脯氨酸除外）在碱性溶液中与水合茚三酮共热时，产生紫色化合物，最大吸收波长在570nm处，在一定浓度范围内，颜色深浅与氨基酸含量成正比，可用比色法进行测定。氨基酸与茚三酮的反应分两个步骤：2.实验材料、仪器与试剂材料：酱油仪器：可见分光光度计，分析天平，容量瓶，移液管，具塞刻度试管。试剂：茚三酮、氯化亚锡、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、标准氨基酸（异亮氨酸）。3.实验步骤（1）样品的处理：准确吸取0.5mL酱油于100mL烧杯中，加入5g活性炭和50mL蒸馏水，置于80℃水浴锅中，保持半小时后过滤，用蒸馏水将滤渣清洗数遍，收集滤液于100mL容量瓶中，定容至刻线，摇匀备用。各种试剂加到比色管后混匀，于电炉上沸水浴15min，取出冷却至室温后加水至10mL刻度线，静置15min后，在570nm处测定吸光度，以氨基酸含量(μg)为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。（2）标准曲线的绘制管号1234567氨基酸标准溶液/mL00.50.60.70.80.91.0水/mL1.61.11.00.90.80.70.6磷酸盐缓冲液/mL0.40.40.40.40.40.40.4茚三酮/mL0.40.40.40.40.40.40.4氨基酸含量/μg0100120140160180200按上表加样后混匀，按标准曲线的步骤进行实验，在相同条件下测定样品的吸光度，并在标准曲线上查出氨基酸含量微克数。（3）样品测定管号891011样品溶液/mL00.50.50.5水/mL1.61.11.11.1磷酸盐缓冲液/mL0.40.40.40.4茚三酮/mL0.40.40.40.44.结果计算5.说明及注意事项（1）该法是微量法，对氨基酸的最低检出量可达0.5μg，其其灵敏度高，重现性好。（2）脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应呈黄色，最大吸收波长在440nm处。（3）通常采用的样品处理方法为：准确称取粉碎后的样品5g～10g或吸取液体样品5mL～10mL，置于烧杯中，加入50mL蒸馏水和5g左右的活性炭，加热煮沸，过滤。用30mL～40mL热水洗涤活性炭，收集滤液于100mL容量瓶中，加水至刻度线，摇匀备用。6.思考题（1）茚三酮法测定氨基酸的原理是什么？（2）试比较三种方法测定氨基酸含量的优缺点各是什么？