Western-Blot操作流程及个人心得体会（二）from生物问问我的生物博客Western操作步骤（一）蛋白样品制备（1）单层贴壁细胞总蛋白的提取：1.倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。2.每瓶细胞加3ml4℃预冷的PBS（0.01MpH7.2~7.3）。平放轻轻摇动1min洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。3.按1ml裂解液加10μlPMSF（100mM），摇匀置于冰上。（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合）4.每瓶细胞加400μl含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。5.裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5ml离心管中。（整个操作尽量在冰上进行）6.于4℃下12000rpm离心5min。（提前开离心机预冷）7.将离心后的上清分装转移倒0.5min的离心管中放于-20℃保存。（个人感觉上述方法可操作性有待加强，细胞中蛋白本来就很少，一瓶50ml的细胞有时按照实验要求只能加100~200μl的裂解液，按照上述操作，直接用200μl裂解液进行裂解，根本就不够瓶壁上沾的。本人是先用预冷的PBS（一般数毫升）加入后，用细胞刮刮下细胞，转移至试管中，如果数瓶细胞是收集同一蛋白的，可以放在同一试管，离心后再将蛋白转移到EP管中，这样可操作性就比较强）（2）组织中总蛋白的提取：1.将少量组织块置于1~2ml匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。2.加400μl单去污剂裂解液裂（含PMSF）于匀浆器中进行匀浆。然后置于冰上。3.几分钟后再碾一会儿再置于冰上，要重复碾几次使组织尽量碾碎。4.裂解30min后，即可用移液器将裂解液移至1.5ml离心管中，然后在4℃下12000rpm离心5min，取上清分装于0.5ml离心管中并置于-20℃保存。（3）加药物处理的贴壁细胞总蛋白的提取：由于受药物的影响，一些细胞脱落下来，所以除按（一）操作外还应收集培养液中的细胞。以下是培养液中细胞总蛋白的提取：1.将培养液倒至15ml离心管中，于2500rpm离心5min。2.弃上清，加入4mlPBS并用枪轻轻吹打洗涤，然后2500rpm离心5min。弃上清后用PBS重复洗涤一次。3.用枪吸干上清后，加100μl裂解液（含PMSF）冰上裂解30min，裂解过程中要经常弹一弹以使细胞充分裂解。4.将裂解液与培养瓶中裂解液混在一起4℃、12000rpm离心5min，取上清分装于0.5ml离心管中并置于-20℃保存。（二）蛋白含量的测定（1）制作标准曲线1.从-20℃取出1mg/mlBSA，室温融化后，备用。2.取18个1.5ml离心管，3个一组，分别标记为0μg，2.5μg，5.0μg，10.0μg，20.0μg，40.0μg。3.按下表在各管中加入各种试剂。0μg2.5μg5.0μg10.0μg20.0μg40.0μg1mg/mlBSA－2.5μl5.0μl10.0μl20.0μl40.0μl0.15mol/LNaCl100μl97.5μl95.0μl90.0μl80.0μl60.0μlG250考马斯亮蓝溶液1ml1ml1ml1ml1ml1ml4.混匀后，室温放置2min。在生物分光光度计上比色分析。（2）检测样品蛋白含量1.取足量的1.5ml离心管，每管加入4℃储存的考马斯亮蓝溶液1ml。室温放置30min后即可用于测蛋白。2.取一管考马斯亮蓝加0.15mol/LNaCl溶液100μl，混匀放置2分钟可做为空白样品，将空白倒入比色杯中在做好标准曲线的程序下按blank测空白样品。3.弃空白样品，用无水乙醇清洗比色杯2次（每次0.5ml），再用无菌水洗一次。4.取一管考马斯亮蓝加95μl0.15mol/LNaCl溶液和5μl待测蛋白样品，混匀后静置2min，倒入扣干的比色杯中按sample键测样品。注意：每测一个样品都要将比色杯用无水乙醇洗2次，无菌水洗一次。可同时混合好多个样品再一起测，这样对测定大量的蛋白样品可节省很多时间。测得的结果是5μl样品含的蛋白量。（上述方法只是一家之言，可以自我变通，本人就不是按照上述方法进行的）（三）SDS-PAGE电泳（1）清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。（2）灌胶与上样1.玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。（可以用1%琼脂糖在垂直电泳槽的左、...
