技术与方法蛋白质双向电泳图像分析3贾宇峰1)林秋霞1)郭尧君2)33郭鹞3)刘少君1)33(1)军事医学科学院基础医学研究所神经生物学研究室,北京100850;2)中国科学院生物物理研究所,北京100101;3)第四军医大学预防医学系放射医学教研室,西安710032)摘要随着人类基因组计划的接近完成,蛋白质组(proteome)研究成为新的热点.其中高分辨率的双向电泳(two2dimensionalgelelectrophoresis,22DE)技术使对组织或细胞的整个蛋白质组的综合分析成为可能.近年来这一技术有了很大的改进和提高,特别是图像分析系统,算法更为先进,功能日益强大,操作也更简便,为大规模研究提供了良好的工具.使用新一代的2D图像分析系统,对离体培养的雪旺氏细胞的蛋白质样品双向电泳结果进行了初步分析,探讨了在图像扫描、点检测、背景消除、匹配、结果报告和数据分析各步中的技术问题,并报告了进行2D图像分析的体会.关键词双向电泳,蛋白质组,图像分析,软件,雪旺氏细胞学科分类号Q51双向电泳(two2dimensionalgelelectrophoresis,22DE)技术是蛋白质组研究中最为广泛应用的蛋白质分离方法[1].而2D图像分析作为22DE的重要一步,其作用是评价和量化电泳结果.在蛋白质组研究中,从样品制备、第一向等电聚焦(IEF)、第二向SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS2PAGE)、2D图像分析到基质辅助激光解析电离2飞行时间质谱仪(MALDI2TOF2MS)或液相色谱2串联质谱连用(LC2MS/MS)分析,整个技术过程环环相扣,更加复杂.在各个环节中,图像分析既要对上游各步的结果做出定性和定量的评价,将一个直观的蛋白质二维图谱数字化,还要为下一步的分析提供依据.特别是在表达蛋白质组学研究中,需要用图像分析软件通过正常和异常细胞、组织等电泳图谱间的匹配,找出差异蛋白质点:哪些点消失了?哪些点是新出现的?哪些点是相同蛋白,而表达水平有差异等等.将这些目标点切下,通过氨基酸组成分析、N端测序或质谱分析,确定是何种蛋白质,再结合图像分析数据和与内部和外部数据库比较的结果,做出结论.由此可见,2D图像分析在蛋白质组研究中是不可或缺的.正当人类基因组计划即将完成之时,越来越多的实验室开始涉足后基因组(post2genome)领域,蛋白质组研究正在升温.在一些科研机构和生物技术公司的努力下,22DE技术不断出现突破性进展,2D凝胶的分辨率也越来越高.在这种情况下,简单的图像比较是远远不能满足研究需要的,图像采集系统和分析软件必须能够检测到最小的差别和获取最多的信息[1].随着22DE技术和计算机技术的发展,2D图像分析系统的性能有了很大的提高,高分辨率高速度的扫描仪如ImageScanner、STORMscanner和ModelGS2710ImagingDensitometer等,再加上新一代功能强大的软件如ImageMaster2D、PDQuest[2]、MelanieⅡ[3,4]等,为大规模分析做好了准备.我们的实验室正在利用22DE技术开展神经生物学方面的蛋白质组研究工作,已经建立了全套22DE系统,并且应用图像扫描系统和2D图像分析软件对提取的雪旺氏细胞蛋白质样品电泳结果进行了初步分析研究.3国家自然科学基金资助项目(39928015).33通讯联系人.刘少君Tel:010266931304,E2mail:liusj@nic.bmi.ac.cn郭尧君Tel:010264888562,E2mail:yaojun.g@263.net收稿日期:2000204224,接受日期:2000206207·642·生物化学与生物物理进展Prog.Biochem.Biophys.2001;28(2)©1995-2004TsinghuaTongfangOpticalDiscCo.,Ltd.Allrightsreserved.1材料与方法11122DE本文中22DE使用蛋白质样品提取自原代培养的雪旺氏细胞,上样量80μg(Bradford法[5],UnicamUV300紫外2可见分光光度仪定量);第一向IEF使用ImmobilineTMpH3～10线性IPG预制凝胶条(购自AmershamPharmaciaBiotechInc.),在IPGphor�电泳仪(APB公司)上完成,第二向SDS2PAGE使用自制SDS凝胶(250mm×180mm×015mm,T=13%)[6,7],在MultiphorⅡ�电泳仪(LKB公司)上进行;Hoefer凝胶自动染色仪(APB公司)银染[8];染色完成后玻璃纸覆盖,室温下放置数天干胶.112软件与硬件ImageMaster2DElite3101(图像分析软件)和LabScan(扫描控制和分析前处理软件)是由NonlinearDynamicsLtd.开发,购自APB公司.工作站为联想奔月2000电脑,(PentiumII350MHzCPU,64M内存,30G硬盘空间,17寸显示器,显示分辨率1024×768),Windows98操...
