第33卷第3期2003年9月工业微生物IndustrialMicrobiologyV0】．33No．3Sept．2003地衣芽孢杆菌JF—UN122碱性蛋白酶的分离纯化与性质袁铸，王忠彦，胡承，胡永松(1．第-：gi~大学成都军医学院医学检验教研室，成都610083；2．四川大学生命科学学院，成都610064)摘要地衣芽孢杆茵JF—UN122的发酵液，以硫酸铵分段盐析得粗酶，再经DEAE—SephadexA-50吸附色素、CM．SephadexC-50离子交换及SephadexG一75柱层析等步骤获得电泳纯的碱性蛋白酶。SDS-PAGE测得其分子量为31．6KDa。以酪蛋白为底物时，酶的Km为5．26／ag／mL，Vm为20．8／ag／min。酶的最适pH为9．0，最适温度为55℃，pH5～11，55℃以下酶较稳定，对lmol／LH2o2具有一定的耐氧化性。PMSF对酶抑制，二硫苏糖醇(丌)有保护作用，钙离子、EDTA、SDS、尿素等对酶无明显影响。关键词：地衣芽孢杆茵；碱性蛋白酶；纯化；性质碱性蛋白酶广泛应用于洗涤剂、制革、丝绸等行业，尤其广泛用于加酶洗涤剂⋯。1954年，Hagihara纯化了枯草芽孢杆菌蛋白酶(Subtilisin)，1970年Keay等研究了Bacilluspumilus，B．sub—tilis和B．1icheniformis碱性蛋白酶，通过离子交换层析等方法将它们分离纯化，并把这些酶命名为芽孢杆菌肽酶(Bacillopeptidase)。在国内，1984年，邱秀宝等¨研究了短小芽孢杆菌209碱性蛋白酶。1993年，林斌等纯化了地衣芽孢杆菌2709碱性蛋白酶，并对其性质进行了鉴定。为了将地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)JF—UN122的酶学性质与目前碱性蛋白酶生产菌所产酶的酶学性质进行比较，我们从该菌株的发酵液中提纯了碱性蛋白酶，并对其酶学性质进行了研究，从而为该酶的基因工程改性提供了基础。1材料与方法1．1材料1．1．1茵种地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)JF．UN122，四JlI大学微生物工程实验室保藏菌株。1．1．2产酶培养基(％)糊精，6．0；黄豆粉，3．0；KH2PO,，0．3；Na2HPO4，0．04；Na2CO3，0．08；pH8．5。1．1．3有关试剂DEAE—SephadexA_50，CM—SephadexC-50及SephadexG一75系Pharmacia产品，国内分装；其余试剂为国产分析纯或化学纯。1．2方法1．2．1碱性蛋白酶分离纯化取48h发酵液以6000r]min冷冻离心10min，收集上清液并加入硫酸铵，取0．30～0．50饱和度盐析物溶于少量0．05mol／L，pH7．4磷酸缓冲液中，透析去盐。然后将其上DEAE—SephadexA-50阴离子交换柱(1．6×20cm)，用0．05mol／L，pH7．4磷酸缓冲液及含不同浓度氯化钠的磷酸缓冲液，进行梯度洗脱，合并酶活性峰；将合并的酶活性峰溶液上预先用pH7．4的磷酸缓冲液平衡过的CM．SephadexC-50柱(1．6×20cm)。当样品吸附完毕，开始线性梯度洗脱，合并酶活性峰后冷冻干燥；将一定量冻干酶粉溶解后，进行SephadexG．75柱层析(1．6×100cm)，洗脱后收集酶活性峰，冷冻干燥后备用。1．2．2酶活力测定酶活测定及单位规定参照文献[6】，即Folin显色法测o．跏值并计算酶活力。酶活定义为1H】L酶液在测定条件下每分钟产生lpg酪氨酸为一个活力单位。第一作者简介：袁铸(1976～)。男，硕士，讲师。一25—维普资讯http://www.cqvip.com第3期工业微生物第33卷1．2．3纯度鉴定及分子量测定采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)’】1．2．4米氏常数(Kin)和最大反应速度(Vm)测定[8】以酪蛋白为底物，用0．05mo1]L，pH9．5的硼酸缓冲液配成不同浓度，然后与酶液40℃反应lOmin，用F0lin法测活力。根据lineweaver—Burk法计算出Km及Vm值。2实验结果2．1F-UN122碱性蛋白酶的分离纯化2．1．1DEAE—SephadexA-50柱层析器凸01．00．80．60．40．20管号+蛋白峰一酶活性峰层析柱：1．6×20era流速：1．0mrain图1DEAE—SephadexA_50柱层析将酶粗制品溶于少量50mmol／L，pH7．4的磷酸缓冲液中，上预先用该缓冲液平衡过的DEAE—SephadexA．5O阴离子交换柱，洗脱后收集有酶活的蛋白峰(酶活性峰)，结果(图1)发现，酶活主要集中在穿透峰，而大峰则由lmo1]LNaCI强行洗脱。合并穿透峰溶液，透析并冷冻干燥，然后溶于50mmol／L，pH7．4的磷酸缓冲液中。2．1．2CM．SephadexC-50柱层析将经过DEAE．SephadexA．50柱层析所得的酶样上CM．SephadexC-50柱，并用含NaCI的磷酸缓冲液进行梯度...
