农杆菌的转化流程

农杆菌的转化流程方案一1。 农杆菌的培育及感受态的制备① 农杆菌菌株划 YM 平板，26-28℃培育 48 h；② 挑取单菌落接种到 40 ml 无抗生素的 YM 液体培育基中，250 r/min， 26—28℃悬浮培育 12-16 h； ③ 将菌液转入灭过菌的 50 ml 离心管中，4℃，8000 r/min，离心 8 min；④ 弃上清，加入用 100 mM NaCl （4℃预冷)重悬收集的农杆菌；⑤ 4℃,8000 r/min， 离心 8 min;⑥ 弃上清,加入原始菌液 1/50 体积（800l/管（此时的感受态农杆菌可以直接用于转化）并分装成 100l）的 20 mM CaCl2 重悬菌体;⑦ 置液氮中 10 s，放入—20℃冰箱中保存备用。2.农杆菌的转化(冻融法）将感受态农杆菌置于冰上，加入 1g 质粒 DNA（体积不宜超过 10  l）,充分混匀，冰上放置 30 min；② 置液氮中快速冷却约 1min 后迅速转入 37℃水浴中，待其融化；③ 加 1 ml 无抗生素的 YM 液体培育基于 28℃，230 r/min 培育2-4 h；（或直接用 1 mll，留 500  l 于管中④ 3000 r/min 离心 2 min 收集菌体，将上清吸去 500 培育菌直接涂布含抗生素的 YM 平板）;⑤ 重悬菌体并涂布到含有适当抗生素的 YM 平板上吹干, 28℃培育 48 h;⑥ 挑取单菌落接种到筛选液体 YM 培育基中，28℃,250 r/min 培育 48 h，将菌液用于保存或转化；注：EHA105 抗利福平霉素，LBA4404 抗硫酸链霉素.在转化前后的所有培育基中均可加入相应的这两种抗生素，以防止杂菌污染。以上挑菌及抗生素加入工作均在超净台上进行。3．转基因烟草体系的建立⑴ 烟草无菌苗的培育：① 70%乙醇消毒烟草种子30 s 后，用无菌水清洗两次，更换 NaClO 处理 25—30 min,无菌水清洗四次;② 将灭菌后的种子移至 1/2 MS 固体培育基（大量元素、微量元素、CaCl2、FeSO4)、1。0 mg/L 维生素、2。0 mg/L 苷氨酸、3％ 蔗糖、0.6-0。7％ 琼脂(KOH 调至 pH 5。7—5.8），于 25—26℃，14 h 光照/10 h 黑暗条件下萌发;③ 14 天后，将萌发出的烟草幼苗转移至含有相同 1/2 MS 培育基的组织培育盒中，同样条件下继续培育 4—6 周,小苗长出后可用于叶盘转化。⑵ 农杆菌介导的烟草叶盘转化和愈伤组织的筛选于无菌条件下将无菌苗的成熟叶片除去叶边缘和主要叶脉，切成 0。5 cm 的小方块，浸泡在 MS 液体培育基悬浮的用于转化的农杆菌菌液中；② 10 min 后取出叶片于灭菌的滤纸上吸...