农杆菌感受态制备VIP专享

版本一 1。1 农杆菌感受态细胞的制备 1.1.1。 取-70℃保存的 EHA105 于含 50μg/ml 链霉素平板划线，28℃培育。 1。1.2。 挑取单菌落接种于 5ml YM 液体培育基中，220rpm 28℃振荡培育 12-16 hr。 1。1。3。 取 2ml 菌液转接于 100ml YM 液体培育基中， 28℃220rpm 振荡培育至OD600=0。5. 1.1.4. 转入无菌离心管，5000rpm 离心 5min,去上清液。 1 。 1.5. 加 入 10ml 预 冷 的 0.1M 的 CaCl2 溶 液 ， 轻 轻 悬 浮 细 胞 , 冰 上 放 置20min.4℃5000rpm 离心 5min，去上清。 1。1.6。 加入 4ml 预冷的含 15％甘油的 0.1M 的 CaCl2 溶液，轻轻悬浮。 1.1.7. 农杆菌悬浮液分装于无菌 Eppendorf 管中，每管 200μl 冻存于—70℃. 1.2. 双元载体转化农杆菌 EHA105 取 1μg 左右的质粒 DNA 加入到 200ml EHA105 感受态细胞中，混匀后，冰浴 30min，-70℃ 放 置 10min 。 再 在 37℃ 水 浴 5min 或 42℃ 水 浴 1min ， 接 着 冰 浴 2min ， 加 入800mlYM 液体培育基 28℃，175rpm 摇培 3hr 后涂在含 50μg/ml Kanamycin 的 YM 平板上。28℃培育到形成单菌落.其中 YM 可以用 LB 代替 ，第一次的 CaCl2 溶液可用溶液（0.1MCaCl2 0。01Tris—HCl(7.0） 0.01 DTT)替代。版本二 普通农杆菌感受态制备与转化： 1。 挑单菌落于 2ml YEP 培育基（含 Rif20mg/ml）中 28℃过夜活化。 2. 取 2ml 过夜菌液接种于 50ml YEP 培育基中 28℃生长至 OD600 约等于 0。5 左右（4hr）。 3。 5k rpm 离心 5 分钟。 4. 在 10ml 0。15M NaCl 中悬浮细胞. 5. 5 krpm 离心 5 分钟，悬浮细胞于 20ml 冰预冷的 CaCl2。 如不是马上使用，可以将之按 200ul 分装储存于—80℃待用。 6. 加 1ug DNA 于 200ul 感受态细胞中，冰上放置 30 分钟。 7. 液氮中冷冻 1 分钟。 8。 37℃水浴溶化细胞。 9. 加 1ml YEP 培育基,28℃摇床培育 2-4hr（低速)。 10. 离心 1 分钟，悬浮细胞在 100ul YEP 培育基中。 11. 涂板，28℃培育 2-3 天。 版本三 农杆菌感受态细胞的制备 1。挑取少许农杆菌 LBA4404，接种于 5ml LB 液体培育基 (含 50mg/L STR)中,28℃、200r/mim 培育过夜。 2.取 2ml 培育物于 LB 液体培育基 (含 50mg/L STR） 中继续培育，直至 OD800 为...