!"卷#期#$$%年%月生物工程学报!"#$%&%’()*$+,(-.#(/%0"$(,(12&’()!"*’)#!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!+,-./#$$%收稿日期：#$$#0!$0!1，修回日期：#$$#0!#0#$。基金项目：国家高科技研究发展计划项目资助（*’)23%0!$#0$"0440$!）。"通讯作者。56(：230!$034271#27；8,9：230!$034271#27；:0;,<(：/(/=,>?@?6>6A<.B),.).>蛋白质剪切及其应用宋利萍黄华（中国科学院遗传与发育生物学研究所，北京!$$!$!）摘要蛋白质剪切是一种翻译后修饰事件，它将插入前体蛋白的中间的蛋白质肽段（C>A6<>，<>A6->,(D-’A6<>E-,?0;6>A）剪切出来，并用正常肽键将两侧蛋白质多肽链（:9A6<>，E(,>F<>?D-’A6<>E-,?;6>AB）连接起来。在此过程中不需要辅酶或辅助因子的作用，仅需四步分子内反应。C>A6<>及其侧翼序列可以通过突变产生高度特异性的自我切割用于蛋白质纯化、蛋白质连接和蛋白质环化反应，在蛋白质工程方面有广泛的应用前景。关键词蛋白质内含子，蛋白质剪切，环状肽，纯化，蛋白质工程中图分类号G3!1文献标识码H文章编号!$$$0%$3!（#$$%）$#0$#4"0$3#$世纪"$年代，蛋白质剪切的发现开辟了生物化学的新篇章。自从第一个蛋白质剪切元件———芽殖酵母中的&+H<>A6<>基因被报道以来，在真细菌、古细菌、单细胞真核生物中已经陆续发现了!!2种<>A6<>［!］。蛋白质剪切元件———<>A6<>对于蛋白质工程来说是一个功能强大的工具。C>0A6<>载体不仅可用于纯化，表达毒性蛋白，而且可以产生CIJ（C>A6<>;6K<,A6KD-’A6<>(）所需的活性末端，引入在核糖体生物合成过程中不能加入的非天然的氨基酸（如磷酸化或糖基化修饰）、标签、发色基团、部分修饰或标记的蛋白质，研究结构—活性之间的关系。此外，<>A6<>还可以有效的介导蛋白质环化，提高蛋白质的稳定性。本文试从<>A6<>的结构、蛋白质剪切机制、<>A6<>在蛋白质纯化、蛋白质连接、蛋白质环化等方面的应用作一概述。!C>A6<>的结构及蛋白质剪切的机制C>A6<>是一段存在于前体蛋白的蛋白序列，是在蛋白质剪切过程中被剪切出来的片段。大部分<>A6<>均具有双功能：蛋白质剪切活性和自导引核酸内切酶（L’;<>?6>K’>=.(60,B6）活性。自导引核酸内切酶活性是位点特异性的，在识别序列和功能上与核酸内含子的自导引核酸内切酶类似，可以在无<>A6<>的等位基因的双链M*H处定点切割，引起<>A6<>的插入［#］。30%&+HC<>A6<>的N0射线晶体衍射图谱显示它具有双结构域。结构!包含<>A6<>序列的*末端（前!2#个氨基酸）和O末端（最后44个氨基酸），几乎均为"折叠，为剪切结构域。结构#位于二者之间，为自导引核酸内切酶结构域［%］。突变研究及序列数理统计研究表明<>A6<>普遍拥有这种双结构域结构［4，7］。30%&+HC<>A6<>以及4/)P6.H<>A6<>的自导引核酸内切酶结构域的缺失可产生仅具有蛋白质剪切功能的微<>A6<>［3，1］。45%QR-H在天然状态下就缺乏内切酶结构域，但仍具有蛋白质剪切活性。这些发现提示<>A6<>的O端及*端可组装成蛋白质剪切的功能性结构域，而位于中间的结构域对于蛋白质剪切并不重要。但也有例外，在IBDI’(0C<>A6<>内，核酸内切酶的结构域不同大小的缺失均可以导致失去剪切活性［2］。C>A6<>有!$个保守的<>A6<>模体（图!）［"］。其中4个位于自导引核酸内切酶结构域中。C>A6<>和下游69A6<>的第一个残基提供了蛋白质剪切的几乎所有的必要条件。对<>A6<>的多重序列比较发现了4个在剪切邻近区域保守的残基。（<）C>A6<>*0末端的半胱氨酸，苏氨酸或丙氨酸。（<<）C>A6<>O0末端的天冬酰胺。（<<<）位于下游69A6<>的*末端第一个残基处的半胱氨酸、苏氨酸或丝氨酸。此外<>A6<>倒数第二个组氨酸可辅助<>A6<>O末端的切割反应［!$］。蛋白质剪切有%个明显的特点：（!）蛋白质剪切完全由蛋白质内含子的氨基酸介导。（#）蛋白质剪切是一个分子内过程。（%）蛋白质剪切不需要辅酶或代谢能，其过程主要涉及键的重排。蛋白质剪切分为4步（图#）：（!）在剪切体的上游，<>A6<>的第一个残基半胱氨酸或丝氨酸（S6-!）的侧链发生*0S或*0T酰基重排，产生具有易断裂肽键的线性酯键中间体，在中性DL条件下，酰胺键0巯酯键之间的...
