人重组白细胞介素-8在大肠杆菌的表达、鉴定VIP免费

人重组白细胞介素-8在大肠杆菌的表达、鉴定【摘要】目的利用PCR技术扩增hIL-8cDNA，将其连接于原核表达载体pKpL-3a（含PL启动子）中,并在大肠杆菌中表达、鉴定。方法PCR技术扩增hIL-8cDNA获取目的基因，将该基因重组到大肠杆菌表达载体pKpL3a质粒中，重组DNA分子转化到Pop2136大肠杆菌中，利用其所产生的温度敏感性λ阻遏蛋白来调控外源基因表达，经ELISA反应检测其表达水平。结果带hIL-8基因的重组pKpL3a质粒成功转化到Pop2136大肠杆菌中，经诱导，表达了IL-8并经ELISA反应检测了其表达水平。结论：hIL-8成功在大肠杆菌中表达。【关键词】hIL-8PCR重组基因表达正文趋化因子（Chemokine）是一组具有趋化作用的细胞因子，能吸引免疫细胞到免疫应答局部，参与免疫调节和免疫病理反应。白细胞介素-8（Interleukin-8）属于趋化因子家族成员，其分子中含有Cys-X-Cys的三联氨基酸序列，因而属于CXC趋化因子亚家族（α家族）。IL-8的重要生物学功能是对中性粒细胞、嗜碱性粒细胞和T细胞具有区划作用，并可促进中性粒细胞的活化，在炎症反应中是一种重要的炎症因子。另外，IL-8还具有促进造血细胞增殖及新生血管生成作用，在伤口愈合和肿瘤生长及转移的过程中发挥重要作用。由于天然来源的IL-8含量极低，难以大批量制备，因而只能利用基因工程技术进行表达和生产。其基本过程是：获取目的基因；表达载体的选择和构建；目的基因与表达载体的拼接；重组DNA分子转化到大肠杆菌；使其复制转录并合成重组的免疫分子。利用重组技术,可使大肠杆菌成为生产IL-8的生物工厂。这种生物工厂一旦建造成功,只要供给大肠杆菌适当的生长条件,就可提供取之不尽的IL-8。1材料与方法1.1主要材料1.1.1菌株与载体Pop2136大肠杆菌和含pKpL-3a质粒的大肠杆菌由本实验室提供。1.1.2工具酶与试剂TaqDNA聚合酶及其buffer购于北联生物医学工程公司。dNTPmix购于Takara公司。Klenow酶购于北联生物医学工程公司。内切酶StyⅠ、XbaⅠ购于Takara公司。T4DNA连接酶及其buffer购于Takara公司。1.1.3PCR引物的设计、合成上游5ˊ引物：agtgctaaagaacttagatgt；下游3ˊ引物：ccgtctagattatgaattataagccctct(内含XbaⅠ酶切位点和TAA终止密码)由Takara公司合成。1.1.4主要仪器PCR仪，微量加样器（20μl、200μl、1000μl），高速台式离心机，DYY-10型电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统，水浴摇床，孵箱，酶标仪，一次性酶标板等。1.2试验方法1.2.1PCR技术扩增hIL-8cDNA在Eppendorf管中依次加入下列成份构建总体积为50μl的反应体系：ddH2O37μl、10×buffer5μl、dNTPmix5μl、上游引物1μl、下游引物1μl、cDNA模板1μl、Taq酶1μl。调节PCR仪，设置95℃预变5分钟。9430℃秒，6030℃秒，721℃分钟，反应30个循环。最后72℃再延伸5分钟。在设定好的PCR仪上进行反应。反应结束后取出10μl进行琼脂糖凝胶电泳。向管中余下的40μl反应体系中加入Klenow酶1μl，室温30分钟，以修平扩增片段的3ˊ末端。之后转至1.5ml离心管中，加入50μl酚-氯仿-异戊醇并混匀，10000rpm，30秒离心。吸取上层清液转至另一已加入5μl3MNaAc的1.5ml离心管中，加入150μl无水乙醇，-20℃放置1小时。10000rpm，10分钟离心，弃上清，加入0.5ml70%乙醇，10000rpm，5分钟离心，弃上清，空气中干燥，溶于20μlTE。1.2.2DNA琼脂糖凝胶电泳配置0.8%琼脂糖凝胶板。充分凝固后从制胶槽中卸下凝胶板，放入电泳槽，加入TAE（×1），使其液面略高于琼脂糖板，拔出样品梳。DNA样品10μl加5μlGEBS样本液，在蜡面纸上混匀，全部加样于琼脂糖的样品孔中。稳压电泳80v约2小时是溴酚蓝指示剂泳动到适当位置，1-5v/cm。取出凝胶板置溴化乙锭中染色20分钟。在凝胶成像仪观察结果。1.2.3质粒提取从转化平皿上接种一单菌落到LA培液体养基中，37℃震荡培养，待细菌浓度增至OD600=1.5时，收获细菌。取菌液1ml转至Eppendorf管中，8000rpm，2分钟离心，弃上清。加入200μl缓冲液A，充分混匀。加200μl碱溶液裂解细菌，反复倒转管5次至溶液清亮，开盖后能拉出丝状粘稠液体。加200μl乙酸缓冲液，反复倒转管5次混匀，冰浴10分钟（宁短勿长）。10000rpm5分钟离心，上清转至另一Eppendorf管中...