大肠杆菌DNA聚合酶1的作用与应用资料VIP免费

CompanyLOGO大肠杆菌DNA聚合酶I大肠杆菌DNA聚合酶I生物08220814151008肖乐大肠杆菌DNA聚合酶I的活性大肠杆菌DNA聚合酶I的活性5’-3’DNA聚合酶活性15’-3’外切核酸酶活性23’-5’外切核酸酶活性35’-3’DNA聚合酶活性5’-3’DNA聚合酶活性在引物RNA'-OH末端，以dNTP为底物，按模板DNA上的指令由DNApolⅠ使DNA链沿5‘→3‘方向延伸。3'Mg2+,dNTP5'5'3'DNA聚合酶I5’-3’外切核酸酶活性5’-3’外切核酸酶活性从5'→3'方向水解DNA生长链前方的DNA链，主要产生5'-脱氧核苷酸。这种酶活性只对DNA上配对部分(双链)磷酸二酯键有切割活力作用，方向是5'→3'。3'Mg2+5'5'3'DNA聚合酶I3’-5’外切核酸酶活性3’-5’外切核酸酶活性由3’端水解DNA链，反应底物是带3'-OH的双链DNA或单链DNA，其活性从3'-OH端降解ds-DNA，可被5'3'聚合活性封闭，也可被带5'磷酸的dNMP抑制5'Mg2+Mg2+,dNTP3'3'5'DNA聚合酶IDNA聚合酶I活性能发生的反应活性能发生的反应切口平移置换反应活性置换反应置换反应如果只有一种dNTP存在，3'5'外切核酸活性将从3'-OH端降解DNA，而5'3'聚合酶活性又在合成DNA，然后在该位置发生一系列的合成和外切反应，直到露出与该dNTP互补的碱基。3'5'外切酶活性5'3'5'3'聚合酶活性切口平移切口平移首先在镁离子存在下用少量DNaseI处理双链DNA模板，产生少量切口。在切口处利用大肠杆菌DNA聚合酶I的5’-3’外切核酸酶活性是切口沿5’-3’方向移动，同时5’-3’DNA聚合酶活性又不断合成DNA。5'Mg2+DNaseI3'5'dNTP大肠杆菌DNA聚合酶I3'应用应用113’-端的末端标记22切口平移法标记DNA33合成cDNA的第二链3’-端的末端标记3’-端的末端标记先用此酶的3’→5’核酸外切酶活性，切除凸出的3’-粘端，形成5’-凸出粘端；在以其5’→3’聚合酶活性使其使其补平，在高浓度dNTP的条件下，3’-端的外切反应与dNTP的搀入反应达到平衡。若dNTP中有放射性标记的核苷酸，即可使产物成为3’-末端的带标记的DNA。切口平移法标记DNA切口平移法标记DNA在Dnase的作用的基础上产生连内切口，应用此酶的5’→3’聚合酶活性和5’→3’外切酶活性的同步联合反应，使切口沿DNA链从5’-端向3’-端移动。若用聚合反应的原料dNTP带有放射性核素α-32P，就能使生成的双链带有标记物。根据此原理可做DNA杂交探针。合成cDNA的第二链合成cDNA的第二链单链cDNA3’-端可形成发卡结构，便于DNA聚合酶I发挥5’→3’聚合酶活性，合成cDNA的第二链。由于其具有5’-3’外切核酸酶活性，现在已不再用于此应用。CompanyLOGO