海洋环境来源的淀粉酶对生玉米淀粉的降解特性_彭惠VIP免费

中国生物工程杂志ChinaBiotechnology，2012，32(7):79-83海洋环境来源的淀粉酶AmyP对生玉米淀粉的降解特性*彭惠＊＊雷寅刘源涛汪颖(安徽大学生命科学学院安徽省微生物与生物催化工程技术研究中心合肥230039)摘要来自海洋宏基因组文库的α-淀粉酶(AmyP)属于最新建立的糖苷水解酶亚家族GH13_37。AmyP是一个生淀粉降解酶，能有效降解玉米生淀粉。在最适反应条件pH7．5和40℃下，生玉米淀粉的比活达到(39．6±1．4)U/mg。酶解反应动力学显示AmyP可以非常快速的降解生玉米淀粉。对1%的生玉米淀粉降解仅需要30min;4%和8%的生玉米淀粉只需3h。DTT可以显著提高AmyP对生玉米淀粉的降解活性，1%DTT促使活性增加1倍。根据电镜观察和产物分析，认为AmyP是以内腐蚀的模式降解生玉米淀粉颗粒，释放出葡萄糖、麦芽糖和麦芽三糖作为终产物。关键词α-淀粉酶生玉米淀粉糖苷酶家族GH13_37酶解中图分类号Q556收稿日期:2012-05-05修回日期:2012-05-15*安徽省自然科学基金(11040606M65)、安徽省高等学校省级自然科学研究重点项目(KJ2012A017)资助项目＊＊电子信箱:pph0259@126．com淀粉降解在人类生活中占有举足轻重的作用，数以千计的食品、制药、造纸和燃料等产品与淀粉降解直接相关［1］。天然生淀粉是一种结构复杂而致密的颗粒，在应用前往往需要通过强酸、碱、高温或者酶法破坏生淀粉颗粒的结构［2］。酶法降解生淀粉显然更加环保并节约能耗，因此生淀粉降解酶的研究一直受到高度关注。α-淀粉酶(α-amylases，E．C3．2．1．1)隶属于糖苷水解酶13家族(GH13)，是最重要的淀粉降解酶之一。只有少数的α-淀粉酶具有生淀粉降解活性，而且其中的绝大多数来自于陆地生物［2-3］。目前为止只有两个来自海洋细菌的α-淀粉酶被报道具有生淀粉降解活性，分别来自Bacillussp．ALSHL3［4］和B．aquimarisMKSC6．2［5］。最近，我们从海洋宏基因组文库中筛选获得了一个新型的α-淀粉酶(AmyP)，并在此基础上发现了一个新的糖苷水解酶亚家族GH13_37［6］。AmyP的氨基酸序列与已知的α-淀粉酶相似性极低(不超过20%)，而且又具有新型的进化地位，因此，探索AmyP是否具有某些独特的催化特性具有重要的科学价值。通过探索底物利用情况，发现AmyP是一个生淀粉降解酶，能够有效的降解生玉米淀粉。本文报道AmyP对生玉米淀粉的降解研究，为了解这个新的亚家族成员的独特催化特性以及开发新型的酶制剂奠定基础。1材料与方法1．1材料重组表达载体pET32a-AmyP由本实验构建［6］，转化大肠杆菌BL21(DE3)后，16℃诱导表达，AmyP蛋白通过Ni2+亲和层析一步纯化。生淀粉购自河北赵州利民淀粉企业集团总公司和安徽燕之坊食品有限公司。寡糖标准品等购自Sigma-Aldrich公司。0．2mm的G60硅胶板购自青岛海洋化工有限公司。3，5-二硝基水杨酸等化学试剂均为分析纯。1．2测定生玉米淀粉降解活性和蛋白质浓度采用3，5-二硝基水杨酸(DNS)法测定生淀粉降解后释放出的还原糖的量［7］，以葡萄糖为标准［8］。一个标准反应体系包含100μl适当稀释的纯酶和500μl4%(m/V)生玉米淀粉(或者其它生淀粉)。酶和淀粉均配置在100mmol/L磷酸钠钾缓冲液(pH7．5)中，在40℃反应3min，立刻置于冰冷的0．3mol/LNa2CO3溶液中终止反应［9］，随后4℃8000g离心5min，取上清测定还中国生物工程杂志ChinaBiotechnologyVol．32No．72012原糖的量。生淀粉使用前用MilliQ水洗涤5次，除去可能的还原糖。一个标准酶活单位(U)定义为每分钟释放出1μmol还原糖所需的酶量。蛋白质浓度采用Bradford法测定，牛血清白蛋白作为标准蛋白。1．3温度、pH和DTT对生玉米淀粉降解活性的影响在40℃测定不同pH对生玉米淀粉降解活性的影响。缓冲液为100mmol/L磷酸钠钾缓冲液(pH5．0～8．0)和100mmol/L甘氨酸-NaOH缓冲液(pH8．5～9．0)。在最适pH7．5下测定温度对降解活性的影响，温度为0～70℃。不同浓度的DTT与4μg(单位数)的AmyP在冰水混合的水浴锅中190r/min充分作用30min，然后加入标准反应体系所需的淀粉，在上述标准反应条件下测定活性。以未添加DTT的样品作为空白对照。1．4不同生玉米淀粉浓度下的酶解动力学选取了1%、4%、8%和12%的生玉米淀粉，分别加入50U的AmyP。为了防止长时...