活体梨叶片透明方法VIP免费

中国果树ChinaFruits1998(2):47—491998年5月实验技术与方法活体梨叶片透明方法*李保华赵美琦孙月海(中国农业大学植物病理系,北京100094)活体叶片透明技术是研究病原菌侵染、扩展、发病过程及寄主组织病变的重要方法。流行病害的定量研究,尤其对于果树叶部流行病害的定量研究,若以叶片为试材,经透明处理后,不仅可检测病原菌孢子侵入率、菌丝扩展长度,达到定量研究的目的,而且克服了以苗木为试材的诸多弊端。以病原菌侵染、扩展为观察目的的梨树活体叶片透明和染色方法,以往未见报道。我们在梨黑星病的侵染、发病研究中,将用于小麦条锈病组织学观察的水合三氯乙醛煮沸透明〔2〕和乳酚油透明液透明技术〔1〕〔3〕引入到梨黑星病的流行学定量研究中,并对这种透明方法的透明机理和各自应用范围作了进一步的研究。在组织透明的基础上,进一步探讨了表皮剥离方法,以获得对表皮表面结构和孢子侵染位点的清晰观察结果。1材料和方法材料为鸭梨不同叶龄(10—180日龄)完整叶片和叶片的活体徒手切片,厚度为20—100�m。1.1透明方法1.1.1饱和水合三氯乙醛溶液煮沸透明法透明液配制将水合三氯乙醛〔CCl3CH(OH)2〕和蒸馏水按5�2(W/V)的比例混合,待水合三氯乙醛完全溶解后,即配成饱和水合三氯乙醛透明液〔2〕。透明将饱和水合三氯乙醛加热至沸腾,立即放入待透明材料,煮沸1—5分钟。1.1.2乳酚油透明液透明法透明液配制该透明液配制分两步,首先按苯酚20g�甘油40mL�乳酸20mL�蒸馏水20mL的比例,将其配成乳酚油,待苯酚完全溶解,溶液混匀澄清后,按乳酚油200mL�无水乙醇132mL�三氯甲烷66mL的比例配成乳酚油透明液〔1〕。透明将新鲜叶片直接浸入乳酚油透明液中,室温下处理48小时。透明叶片量不能超过透明液量的1/2。1.2染色与脱色染色液的配制称取溴酚蓝1g,溶入100mL水合三氯乙醛溶液中,配成1%溴酚蓝染色液。溴酚蓝染色液可将梨黑星病菌的菌丝细胞壁染成蓝色,而叶组织细胞不被染色。脱色液为饱和水合三氯乙醛。染色和脱色经上述两种方法透明的叶片,浸入染色液中染色48小时。染色完毕,取出染色叶片,用自来水漂去叶片表面的染色液,转入饱和水合三氯乙醛溶液中脱色24小时。脱色后的叶片以甘油作浮载剂制成半永久玻片;脱色后的叶组织也可在饱和水合三氯乙醛溶液中保存。1.3表皮剥离表皮剥离液的配制将草酸和草酸铵分别配成0.8%和3.2%的水溶液,使用时再按1�1的比例混合即成〔4〕。表皮剥离方法将透明或染色脱色的叶片直接浸入表皮剥离液中处理24小时。处理完毕,取出叶片并用清水冲掉表皮剥离液,用摄子撕取表皮,用毛笔刷去附着的叶肉细胞,即可以甘油作浮载剂制片观察。2结果本文于1998-01-18收到。*本研究为国家自然科学基金资助项目,资助号:39470475。本文承蒙曾士迈先生审阅,特致谢忱。472.1饱和水合三氯乙醛溶液煮沸透明法经饱和水合三氯乙醛透明的叶片,纵切片在显微镜下观察,仅能检查到叶组织细胞壁、细胞核和维管束的纤维素类物质,细胞膜和叶绿体、线粒体等细胞器均受到破坏,细胞内容物消失,这说明水合三氯乙醛主要通过破坏细胞膜、消解细胞质,来达到透明效果。如果煮沸时间过长,细胞壁也将被逐渐消解。图A为饱和水合三氯乙醛溶液煮沸透明后鸭梨叶片纵切片(10×4倍),图B为饱和水合三氯乙醛溶液煮沸透明后的叶肉细胞(10×40倍)。饱和水合三氯乙醛溶液煮沸透明对梨各龄期叶片都能获得较好的透明效果,不同龄期叶片透明需要煮沸的时间有所差异,幼嫩叶片煮沸时间短,一般不超过3分钟;叶龄30日以上的叶片,煮沸时间可适当延长,透明过程中可随时检查透明效果,以叶片刚好完全透明为止。图F为鸭梨35日龄叶片经饱和水合三氯乙醛溶液煮沸透明3分钟、溴酚蓝染色48小时和饱和水三氯乙醛脱色24小时的显微照片,照片中梨黑星病菌分生孢子接种4天后在角质层下形成的菌丝(10×40倍)清晰可见。2.2乳酚油透明液透明法经乳酚油透明液透明的叶片,其纵切片在显微镜下观察细胞结构完整,与透明前相比,细胞质稠密,细胞质与细胞壁略有分离,叶绿体消解为多个微小的棕色颗粒,叶绿素消失。由此说明,该透明液主要通过分解叶绿素,破坏叶绿体达到透明的效果,对细胞膜和细胞质损伤不大。图C为该透明液透明的鸭梨叶片纵切片(10×40倍),图D为...