中国神经精神疾病杂志2014年第40卷第4期肝豆状核变性的基因诊断☆刘磊磊*汤其强*韩若东肖晗*【关键词】肝豆状核变性基因诊断WD基因肝豆状核变性又称威尔逊病（Wilson'sdisease，WD），系常染色体隐性遗传性铜代谢障碍疾病。世界范围发病率为1/10万-1/3万[1]，杂合子频率为1/100~1/200[2]，其中中国是高发区。该病是由于ATP7B基因突变，导致铜转运P型ATP酶缺失，从而导致血浆铜蓝蛋白降低及铜在体内器官的沉积等一系列临床表现。WD是目前少数可以治疗的神经遗传病之一，患者如果能在发病早期或症状前期即被确诊并得到及时治疗，大多预后良好，反之病情逐渐加重甚至危及生命[3]。目前临床上多是根据患者临床表现结合铜生化检测加以诊断，但并非所有患者都有生化方面的变化，大约40%的症状前期患者每天尿排铜量小于100µg，并且尿铜含量增高出现相对较晚，因此基因诊断至关重要[4]。基因诊断是WD病的最为明确、有效的诊断方法，对患者的家系成员，尤其是同胞应早期进行ATP7B基因突变筛查，有望检出症状前患者或轻症患者。本文就WD病的基因诊断技术做一综述。1传统的检测标准目前对WD病多采用以下标准[5]：①家族遗传史：父母是近亲婚配，同胞有WD患者或死于原因不明的肝病；②缓慢进行性震颤、肌僵直、构音障碍等锥体外系症状、体征或/和肝症状；③肉眼或裂隙灯证实有K-F角膜色素环；④血清铜蓝蛋白<200mg/L或血清铜氧化酶<0.2活力单位；⑤24h尿铜排泄量>100μg(1.56μmol)；⑥肝铜>250μg/g(干重)。判断：凡完全具备上述①~③项或l及4项者，可确诊为临床表现型；具备③~⑤者或③～④项者属症状前型。仅有①～②项或①、③项者，应怀疑WD，通过第⑥项确诊。2基因检测方法2.1家系连锁分析其原理是将待检家族成员基因与先证者的遗传标记进行基因连锁分析，从而进行诊断。方法包括限制性片段长度多态性(restrictionfragmentlengthpoly⁃morphism，RFLP)、短串联重复序列(shorttandemrepeat，STR)和单核苷酸多态性（singlenucleotidepolymorphism，SNP）。1989年Figus等[6]首先采用RFLP法开始了WD的基因诊断，成功地在WD先证者家系中筛选到症状前患者和杂合子。RFLP法是早期的基因检测方法，但因其信息量少等原因而不适用于临床。STR又称微卫星DNA，与RFLP相比，具有分布广泛、高多态性、高杂合性、易于确定基因型等优点。Thomas等[7]利用微卫星DNA对WD患者家系进行分析，表明该标记也可用于WD先证者家系成员的诊断，且检出率更高。国内王丽娟等[8]也利用5个微卫星DNA标记对22个WD进行了单倍体连锁分析，取得了满意的结果。孟晓燕等[9]运用多个短串联重复序列(STR)多态性位点单体型分析析对肝豆状核变性(WD)携带者进行筛查及产前诊断，检测D13S296、D13S301和D13S3163个位点，证实该方法准确快速。以上方法所用酶DNA遗传标记与WD基因距离较远、重组率高，且必须与同一家系的先证者进行比较，因此不能用于无先证者的拟诊患者。DNA序列单个碱基的差别可造成DNA片段构象变化而作为多态性标记，称单核苷酸多态性（SNP）。2007年Harmut[10]、Gupta等[11]选择了4个WD基因的SNP位点对印度人WD家系进行检查，检测效果较好，证明SNP具有遗传稳定、重组率低等特点。若将其与PCR、RFLP等方法结合起来可大大提高基因诊断效率。2.2聚合酶链反应（PCR）分析技术PCR分析技术方法包括聚合酶链反应一单链构象多态性(polymerasechainreac⁃tion-singlestrandconformationpolymorphism，PCR-SSCP)；PCR酶切和荧光PCR技术，多重PCR等。PCR-SSCP灵敏度较离，适用于单个碱基插入、置换或缺失的检测。操作相对简单费用较低，但由于不能明确突变部位和性质，且易出现假阳性或假阴性结果。多用于突变的筛选，其最终结果需经DNA测序证实。1997年Maier-Dobeersberger等[12]以半巢式PCR酶切分析法率先开展了对WD直接基因诊断的尝试，针对14号外显子His1069Gln进行突变筛选而检出症状前患者和杂合子。此后国内马少春等以MspI酶切法对8号外显子778密码子突变进行了检测[13]，随后黄帆等以荧光PCR法对Arg778Leu突变进行检测[14]，均取得了满意的结果。国内针对8号外显子的突变热区采用酶切分析、荧光聚合酶链反应等方法...
