热盐水致大鼠萎缩性胃炎胃粘膜组织细胞凋亡及其调控基因蛋白表达影响的实验研究西安市中心医院消化科(西安710003)张玲霞张沥徐俊荣贾长河张宁霞曹广周摘要目的:研究热盐水灌胃导致的大鼠萎缩性胃炎胃粘膜组织中的凋亡细胞及其调控基因Bcl22、Fas表达状态,以探讨长期热咸饮食与慢性萎缩性胃炎发生的关系。方法:采用脱氧核糖核酸转移酶介导等缺口末端标记(TUNEL)技术及免疫组织化学染色技术。细胞凋亡时DNA含量分析采用流式细胞检测技术。结果:TUNEL检测细胞凋亡显示,在热盐水所致的大鼠萎缩性胃炎中凋亡细胞数明显增多,在粘膜全层均可见到,呈弥漫性分布。萎缩性胃炎中凋亡细胞指数显著高于正常大鼠胃粘膜;免疫组化法检测凋亡相关基因显示,Bcl22、Fas在热盐水灌胃所致的萎缩性胃炎中的表达率显著高于正常胃粘膜;热盐水灌胃不同时间大鼠胃粘膜中Bcl22、Fas蛋白表达率随灌胃时间延长而逐渐增加,在4周、8周、12周时Bcl22蛋白表达率分别为12.5%、16.7%、76.5%,Fas蛋白表达率分别为18.75%、22.2%、64.7%;流式细胞检测显示,在萎缩性胃炎时,在G0�G1峰前可见一个亚G0�G1峰,也即凋亡细胞峰出现,而在正常胃粘膜时未显示亚G0�G1峰。结论:热盐水灌胃可导致大鼠胃粘膜组织细胞凋亡异常,其调控基因(Bcl22、Fas)在热盐水所致的大鼠萎缩性胃炎发生中起重要作用。主题词胃炎,萎缩性�病理学氯化钠类�副作用@细胞凋亡基因,调节大鼠本研究采用脱氧核糖核酸转移酶介导等缺口末端标记(TUNEL)技术、流式细胞检测技术及免疫组织化学染色技术对热盐水灌胃导致的大鼠萎缩性胃炎胃粘膜上皮组织中的凋亡细胞及其调控基因(Bcl22、Fas)表达状态进行观察,以探讨它们在热盐水灌胃导致的大鼠萎缩性胃炎发生中所起的作用,探讨食物的温度及咸度造成胃粘膜萎缩的原因,为预防胃癌前病变和胃癌的发生提供实验依据。材料与方法1材料100只7周龄健康、性成熟的雄性SD大鼠,体重200～250g,由第四军医大学动物实验中心提供;细胞凋亡试剂盒(InSituCellApoptosisDetctionKitI,POD),SABC、即用型试剂盒、Bcl22、Fas一抗、生物素化的二抗均购自武汉博士德生物技术公司;流式细胞检测采用USA2Coulter公司流式细胞仪(ELITE型)。2方法2.1大鼠萎缩性胃炎模型的制作:采用55℃、15%的盐水连续灌胃12周,制成大鼠萎缩性胃炎模型,在灌胃期间每隔4周处死一批大鼠。对照组采用等量的蒸馏水灌胃12周。具体造模方法见参考文献[1]。收集制模阶段的大鼠胃粘膜石蜡包埋标本68例(其中萎缩性胃炎标本34例)及对照组大鼠胃粘膜石蜡包埋标本32例进行检测。2.2细胞凋亡的检测:采用末端转移酶介导的dUTP切口末端标记法(TUNEL)。染色步骤:①4Λm石蜡切片经二甲苯脱蜡,梯度乙醇水化;②新鲜配制3%H2O2及90%甲醇混合液封闭,室温处理10min阻断内源酶;③加TBS1:100稀释ProteinaseK37℃消化15min;④加标记缓冲液(LabelingBuffer)20Λl�片,以保持切片湿润,4℃过夜20h,取出再置37℃标记2h;⑤加封闭液50Λl�片,室温30min;⑥用封闭液1∶100稀释生物素化抗地高辛抗体,50Λl�片,37℃反应30min;⑦用TAB1∶100稀释SABC,混匀后加至切片,012陕西医学杂志2003年3月第32卷第3期37℃反应30min;2～3步后蒸馏水洗涤3次,每次2min;6～7步后TBS洗涤3次,每次2min;⑧DAB2H2O2显色10min,苏木素轻度复染,脱水透明,封片。2.3免疫组织化学染色:采用SABC即用型试剂盒,切片常规脱蜡水化,经3%过氧化氢290%甲醇封闭内源性过氧化物酶20min,微波修复抗原10min,山羊血清孵育25min后加一抗(P53、ras),4℃冰箱过夜,次日加对应的生物素化二抗,37℃,30min;ABC复合物,37℃,30min。之后用DAB显色。以上各步骤除血清孵育后甩干血清直接加一抗外,均间以PBS洗涤3次,每次3～5min。显微镜下观察DAB显色满意后自来水冲洗5min;苏木素复染5s,自来水冲洗5min;最后脱水,透明,封片。2.4流式细胞检测技术:采用USA2Coulter公司流式细胞仪(ELITE型)进行检测。①将石蜡包埋组织(50Λm厚组织切片)放入试管中,经二甲苯脱蜡,梯度乙醇水化;②加入胃蛋白酶(pH1.5)消化30min,经350目尼龙网过滤,离心(500～800r�min);③收集细胞悬液,以预冷的70%乙醇固定待检;④PI(碘化丙啶)染色,在4℃暗处避光30min,用流式细胞仪进行检测,...
