麦胚凝集素红细胞凝集活性检测方法的改进VIP专享VIP免费

第23卷第1期2004年1月无锡轻工大学学报JournalofWuxiUniversityofLightIndustryVol.23No.1Jan.2004文章编号:10092038X(2004)0120049205收稿日期:2003205213;修回日期:2003209211.作者简介:单良(19692),男,山东新泰人,食品科学与工程博士研究生.麦胚凝集素红细胞凝集活性检测方法的改进单良,姚惠源(江南大学食品学院,江苏无锡214036)摘要:对红细胞进行蛋白酶处理、戊二醛固定,采用pH7.2等渗磷酸盐作为缓冲液,用光径0.5cm比色池测定凝集活性,读取测定终点的时间以2h为宜.建立的检测方法简单易行,得出的结果具有良好的灵敏度及重现性.关键词:麦胚凝集素;红细胞凝集活性;检测方法中图分类号:R446文献标识码:AAnImprovedProtocolforDeterminationofHemagglutinatingActivityofWheatGermAgglutininSHANLiang,YAOHui2yuan(SchoolofFoodScienceandTechnology,SouthernYangtzeUniversity,Wuxi214036,China)Abstract:Theprocedurefordeterminationofhemagglutinationactivity(HA)ofwheatgermagglutinin(WGA)wasimproved.Majorimprovementsinclude:1).theselfsedimentationoferythrocyteswasdeductedinthedefinitionandcalculationofHA;2).erythrocytesweresensitizedwithtrypsinandfixedwithglutaraldehydepriortoHAtests;3).pH7.2isotonicphosphatebufferedsalinewasusedastheworkingliquid;4).UVabsorptionoferythrocytesuspensionswastakenusing0.5cmpath2lengthcells;and5).appropriateend2pointwasdeterminedas2hoursafteraddingWGAintothesuspension.Theprotocolthusderivedwasprovedtobeconvenient,capableofhavinggoodsensitivityandreproducibility.Keywords:wheatgermagglutinin(WGA);hemagglutinatingactivity(HA);determination麦胚凝集素(wheatgermagglutinin,WGA)是具有结合甲壳素功能的凝集素家族(Gramineae)中的一员,与其它家族相比,这类凝集素的独特性在于其分子内部的四重折叠结构具有多个结合位点.WGA以3种变异体(同功凝集素)的形式存在,三者都是36000的二聚体,由2个相同的具有171个残基的多肽链缔合而成,每条多肽链包含4个重复的42～43个残基的橡胶蛋白型结构域.这些结构域以相似的方式折叠而成,并由相对位置相同的4个二硫键稳定其结构,这些结构域依次排列,以“头对尾”的方式形成二聚体,形成广泛的单体/单体界面.这种界面容纳接触亚基之间8个独立的糖结合位点(4个异常位点),其特点是具有一簇2～3个芳香氨基酸[1,2].凝集素与复合多糖的特异性相互作用参与噬菌作用、细胞内吞作用、细胞内运送、信号转换、细胞2细胞识别、发炎过程、细胞基质粘着、调理作用、细胞生长控制、细胞调节和分化、细胞运送以及肿瘤细胞转移等[5].WGA具有特定的细胞凝集活性,其活性可以利用天然的、酶处理的、戊二醛固定的人、兔、绵羊血红细胞,或者(KB)细胞、成纤维细胞配制成一定浓度的悬液,将1mg/mL的WGA溶液进行系列2倍稀释,然后向其中加入等量的细胞悬液,在一定条件下静置一定时间后,利用肉眼观测、比色等方法进行判定.在建立标准的红细胞凝集2红细胞抑制实验方法时,有2个方面值得注意:首先,在诊断学中,病毒的红细胞凝集2红细胞凝集抑制实验必须尽可能敏感可靠;其次,需要有一个标准化的操作过程,不同实验室测定时可作为参照[4].现有的WGA红细胞凝集活性检测方法主要存在以下问题:(1)是配制标准细胞悬液方法不一,重现性差,而且许多方法要求用新鲜血液当天配制红细胞悬液;(2)确定读取终点时间的随意性较大;(3)测定方法繁多,测定结果难以进行比较.对于上述问题的解决,将有助于改善测定方法的适用性、测定结果的灵敏度和重现性.1材料与方法1.1材料与仪器WGA标准品:Sigma公司产品,批号L29640;测试样品WGA:作者自行纯化,在SDS2PAGE上显示单带;人全血A型:Rh(2),购自无锡市红十字中心血站;胰蛋白酶:PTN6.0S无盐型,Novozymes公司上海代表处提供;戊二醛25%水溶液:上海生化试剂公司产品.冷冻离心机:20PR252D型,日本HitachiKokiCo.Ltd.产品;UV21100紫外2可见分光光度计:北京瑞利分析仪器公司产品.1.2实验方法1.2.1标准血红细胞悬液的配制红细胞的分离:采用参考文献[5]方法分离;红细胞的胰蛋白酶处理:Vret...