实验三_硝酸还原酶活性测定VIP免费

实验实验33硝酸盐和光诱导对硝酸还原硝酸盐和光诱导对硝酸还原酶（酶（NRNR）活性的影响）活性的影响硝酸还原酶植物从土壤中吸收的NO3－必须经代谢性还原才能被利用，因为细胞组分中的N均呈高度还原态，而NO3－中的N为高度氧化态。硝酸盐的还原由硝酸还原酶(nitratereductase,NR)催化。硝酸还原酶存在于细胞液中，为一种诱导酶。诱导酶(inducedenzyme):植物体本来不含有，但在特定外来物质(如底物)的诱导下,可以产生的酶。受光促进1.实验目的意义掌握硝酸还原酶活性的测定方法了解硝酸还原酶的特性硝酸还原酶（EC.1.6.6.1，缩写NR）是硝酸盐同化中第一个酶，也是限速酶，处于植物氮代谢的关键位置。它与植物吸收利用氮肥有关，对农作物产量和品质有重要影响，因而硝酸还原酶活性被当作植物营养或农田施肥的指标之一，也可作为品种选育的指标之一。硝酸还原酶可将NO3-还原成NO2-，其反应为：NO3-+NADH+H+NO2-+NAD++H2ONR在一定条件下，NO2-的生成量与硝酸还原酶的活性呈正相关，因此，可以测定NO2-的生成量来代表硝酸还原酶的NR活性。2.实验原理NO2-含量测定（磺胺比色法）在酸性溶液中，NO2-与磺胺形成重氮盐，重氮盐再与α-萘胺偶联，形成紫红色的偶氮化合物。该偶氮化合物在540nm有最大吸收峰，可以用分光光度计测定（OD540）。（不稳定，见光容易分解，测定需迅速。）当磺胺与α-萘胺均过量时，所生成的红色深浅与NO2-含量成直线关系。NO2-含量标准曲线：[NO2-](µmol/ml)=0.0026＋0.359OD540NR活性(NO2-,µmol/h•gfw)=鲜重(g)×时间(h)[NO2-](µmol/ml)×稀释倍数离体法：将材料磨成匀浆，经过滤或离心除去残渣，以上清液为硝酸还原酶粗酶液进行测定。缺点：由于研磨中NADH受损失，必需外加NADH方可测定。活体法：直接用鲜活组织进行测定。环境中的NO3-进入细胞后被NR还原成NO2-，并扩散到细胞外在溶液中积累，测定溶液中NO2-的含量即可得知NR的大小。优点：不破坏细胞原有的酶反应系统，NADH可由代谢反应不断生成，无需外加。简便、快速，不需要贵重仪器设备及低温条件。缺点:重复性欠佳，应作一定量的重复。硝酸还原酶活性测定3.材料与试剂两种处理的小麦：水(ck)，KNO3（N）A液：磷酸缓冲液:水:DNP溶液:蔗糖溶液＝5:5:1:1B液：磷酸缓冲液:KNO3:DNP溶液:蔗糖溶液＝5:5:1:1磷酸缓冲液(pH7.5):0.2mol/L；KNO3溶液:0.2mol/LDNP(2-4-二硝基苯酚)溶液:1mmol/L；蔗糖溶液:2.5mmol/L磺胺试剂α-萘胺试剂①取样前一天，用50mMKNO3加到培养小麦的水中，光照，以诱导硝酸还原酶产生。②两种材料[水(ck)，KNO3(N)]各取2份新鲜叶片中段，用蒸馏水洗净、擦干，剪成1cm小段，称取0.3克；将4份（ck、N）叶段分别置于含有10mlA、B溶液的两只试管中，即ckA、ckB、NA和NB四管；③用纱布将材料压于试管底部，将试管放在真空干燥器中抽气30分钟，放气后摇晃直至叶段沉于溶液中；④将试管置于25～30℃温箱中，黑暗保温30分钟；⑤取A液和B液1ml代替反应液，加入2ml磺胺试剂和2mlα-萘胺试剂，作为测定样品吸光值的对照管。⑥立即吸取1ml反应液，加入2ml磺胺试剂，摇匀，再加入2mlα-萘胺试剂（注意顺序），用漩涡仪混合摇匀，25℃水浴（水浴锅）反应5分钟,取出后桌面静置10分钟，随后5分钟内，在540nm测定样品的吸光值。。4.实验步骤两种处理的小麦幼苗叶片中段各取0.3g(各2份)麦苗~水(ck)麦苗KNO3（N）10mlA液B液A液B液抽气30分钟25～30℃温箱中黑暗保温30分钟取1ml反应液+2ml磺胺试剂+2mlα-萘胺试剂混匀注意加液顺序25℃水浴反应5分钟取出后桌面静置10分钟540nm测定样品的吸光值取A液或B液1ml代替反应液作为对照管放气后摇晃直至叶段沉于溶液中5.结果与分析处理A液B液吸光度[NO2-]NR活性吸光度[NO2-]NR活性（uMol/ml）（uMol/h•gfw）（uMol/ml）（uMol/h•gfw）H2OKNO3对照[NO2-]（uMol/ml）=0.0026＋0.359OD540NR活性（NO2-,uMol/h•gfw）=[NO2-]×10ml/1ml÷（鲜重g×0.5h）分析硝酸盐对硝酸还原酶活性的影响。6.注意事项①抽真空放气后，摇晃直至叶段沉于溶液中；②硝酸还原过程应在黑暗中进行；③磺胺试剂和α-萘胺试剂加入时，注意顺序；④正确使用分光光度计；⑤避免移液管使...