牛乳中金黄色葡萄球菌山东分离株(zfb)β-溶血素(hlb)的克隆,表达及溶血活性分析VIP免费

中国农业科学2009,42(1):324-330ScientiaAgriculturaSinicadoi:10.3864/j.issn.0578-1752.2009.01.042收稿日期：2008-01-02；接受日期：2008-09-05基金项目：山东省中青年科学家基金（200606010），山东省自然科学基金（Y2007D10），山东省农科院高技术自主创新基金（2006YCX027），四川省教育厅自然基金预研项目（2003C001）作者简介：杨钦（1981－）男，山东淄博人，硕士研究生，研究方向反刍动物疾病学。Tel：13515360205；E-mail：sdyangqin@163.com。通信作者王长法（1967－），男，江苏淮安人，副研究员，研究方向为奶牛免疫学。Tel：0531-88604132，13153027328；E-mail：wcf1967@yahoo.com.cn；彭广能（1966－），男，重庆石柱人，教授，研究方向为临床兽医学。Tel：13981606712；E-mail：pgn.sicau@163.com牛乳中金黄色葡萄球菌山东分离株（zfb）β-溶血素(hlb)的克隆、表达及溶血活性分析杨钦1,2,3，王长法1，杨宏军1，杨少华1，高运东1，仲跻峰1，彭广能2（1山东省农业科学院奶牛研究中心，济南250100；2四川农业大学动物医学院，四川雅安625014；3山东省潍坊市昌乐县畜牧局，山东潍坊262404）摘要：【目的】实现牛乳中金黄色葡萄球菌β-溶血素在大肠杆菌中的高效表达,并分析重组β-溶血素的溶血活性。【方法】PCR扩增牛乳中金黄色葡萄球菌山东分离株β-溶血素基因，构建原核表达载体pET32a+/hlb,并在大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达，用96孔血凝板测定重组蛋白的溶血效价，以血琼脂平板法检测重组蛋白的CAMP反应。【结果】测序结果表明，扩增片段含有993bp的ORF，可编码含330个氨基酸的成熟蛋白；SDS-PAGE分析重组蛋白表达水平，IPTG诱导后表达的融合蛋白分子量为57kD，表达量占菌体总蛋白的23.9%；溶血效价分析，金葡菌β-溶血素对绵羊红细胞的溶血效价为278HU·mg-1，对奶牛红细胞的溶血效价为9×103HU·mg-1；重组蛋白在血琼脂平板上和无乳链球菌能发生明显的CAMP反应。【结论】成功表达了牛乳中金黄色葡萄球菌β-溶血素，该毒素对奶牛红细胞的溶血活性明显大于绵羊红细胞，显示出牛源金黄色葡萄球菌β-溶血素的特性明显不同于人源金黄色葡萄球菌β-溶血素，为进一步研究其致病与免疫机理、疫苗设计提供了理论基础。此外，重组蛋白还可用来特异性诊断、鉴别无乳链球菌，为兽医临床诊断提供新的方法。关键词：金黄色葡萄球菌;β-溶血素；克隆；表达；溶血活性；CAMP反应Expressionofβ-hemolysinGeneofStaphylococcusaureusStrainsShandong(zfb)andItsHemolyticActivityYANGQin1,2,3,WANGChang-fa1,YANGHong-jun1,YANGShao-hua1,GAOYun-dong1,ZHONGJi-feng1,PENGGuang-neng2(1ResearchCenterofDairyCattle,ShandongAcademyofAgriculturalScience,Jinan250100;2CollegeofAnimalMedicalScience,SichuanAgriculturalUniversity,Yaan625014,Sichuan;3ChanglePrologueBureau,Weifang262404,Shandong)Abstract:【Objective】Thegenecodingthebeta-hemolysinwasclonedfromStaphylococcusaureusShandongstrainZfb,expressedinEscherichiacoli,andthehemolyticactivityoftherecombinantproteinwasanalyzed.【Method】hlbgenewasclonedfromgenomicDNAofStaphylococcusaureusbyPCR,andthePCRproductwasinsertedintovectorpET32a+toconstructplasmidpET32a+/hlb,theplasmidwasthenexpressedinEscherichiacoliBL21(DE3)cellsthatinducedbyIPTG..Thehemolyticactivitywasevaluatedby96wellmicrotiterV-platesusingpurifiedtherecombinationproteinagainstsheepandbovineerythrocytesandCAMPreactionwithStreptococcusagalactiae.【Result】SequenceanalysisshowedthattheStaphylococcusaureusβ-hemolysingene(hlb)wascomposedof993nucleotidesencodingamaturepolypeptide330aminoacids;SDS-PAGEresultsshowedthattherecombinantproteinswereexpressedininclusionbodiesinEscherichiacoliwithmolecularweightof57kDandtherecombinantproteinsaccountedfor23.9%ofthewholeproteins.Thepurifiedproteinhlbhas278HU·mg-1tosheeperythrocytesand9×103HU·mg-1tobovineerythrocytes.The...