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牛乳中金黄色葡萄球菌山东分离株(zfb)β-溶血素(hlb)的克隆,表达及溶血活性分析VIP免费

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中国农业科学2009,42(1):324-330ScientiaAgriculturaSinicadoi:10.3864/j.issn.0578-1752.2009.01.042收稿日期:2008-01-02;接受日期:2008-09-05基金项目:山东省中青年科学家基金(200606010),山东省自然科学基金(Y2007D10),山东省农科院高技术自主创新基金(2006YCX027),四川省教育厅自然基金预研项目(2003C001)作者简介:杨钦(1981-)男,山东淄博人,硕士研究生,研究方向反刍动物疾病学。Tel:13515360205;E-mail:sdyangqin@163.com。通信作者王长法(1967-),男,江苏淮安人,副研究员,研究方向为奶牛免疫学。Tel:0531-88604132,13153027328;E-mail:wcf1967@yahoo.com.cn;彭广能(1966-),男,重庆石柱人,教授,研究方向为临床兽医学。Tel:13981606712;E-mail:pgn.sicau@163.com牛乳中金黄色葡萄球菌山东分离株(zfb)β-溶血素(hlb)的克隆、表达及溶血活性分析杨钦1,2,3,王长法1,杨宏军1,杨少华1,高运东1,仲跻峰1,彭广能2(1山东省农业科学院奶牛研究中心,济南250100;2四川农业大学动物医学院,四川雅安625014;3山东省潍坊市昌乐县畜牧局,山东潍坊262404)摘要:【目的】实现牛乳中金黄色葡萄球菌β-溶血素在大肠杆菌中的高效表达,并分析重组β-溶血素的溶血活性。【方法】PCR扩增牛乳中金黄色葡萄球菌山东分离株β-溶血素基因,构建原核表达载体pET32a+/hlb,并在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,用96孔血凝板测定重组蛋白的溶血效价,以血琼脂平板法检测重组蛋白的CAMP反应。【结果】测序结果表明,扩增片段含有993bp的ORF,可编码含330个氨基酸的成熟蛋白;SDS-PAGE分析重组蛋白表达水平,IPTG诱导后表达的融合蛋白分子量为57kD,表达量占菌体总蛋白的23.9%;溶血效价分析,金葡菌β-溶血素对绵羊红细胞的溶血效价为278HU·mg-1,对奶牛红细胞的溶血效价为9×103HU·mg-1;重组蛋白在血琼脂平板上和无乳链球菌能发生明显的CAMP反应。【结论】成功表达了牛乳中金黄色葡萄球菌β-溶血素,该毒素对奶牛红细胞的溶血活性明显大于绵羊红细胞,显示出牛源金黄色葡萄球菌β-溶血素的特性明显不同于人源金黄色葡萄球菌β-溶血素,为进一步研究其致病与免疫机理、疫苗设计提供了理论基础。此外,重组蛋白还可用来特异性诊断、鉴别无乳链球菌,为兽医临床诊断提供新的方法。关键词:金黄色葡萄球菌;β-溶血素;克隆;表达;溶血活性;CAMP反应Expressionofβ-hemolysinGeneofStaphylococcusaureusStrainsShandong(zfb)andItsHemolyticActivityYANGQin1,2,3,WANGChang-fa1,YANGHong-jun1,YANGShao-hua1,GAOYun-dong1,ZHONGJi-feng1,PENGGuang-neng2(1ResearchCenterofDairyCattle,ShandongAcademyofAgriculturalScience,Jinan250100;2CollegeofAnimalMedicalScience,SichuanAgriculturalUniversity,Yaan625014,Sichuan;3ChanglePrologueBureau,Weifang262404,Shandong)Abstract:【Objective】Thegenecodingthebeta-hemolysinwasclonedfromStaphylococcusaureusShandongstrainZfb,expressedinEscherichiacoli,andthehemolyticactivityoftherecombinantproteinwasanalyzed.【Method】hlbgenewasclonedfromgenomicDNAofStaphylococcusaureusbyPCR,andthePCRproductwasinsertedintovectorpET32a+toconstructplasmidpET32a+/hlb,theplasmidwasthenexpressedinEscherichiacoliBL21(DE3)cellsthatinducedbyIPTG..Thehemolyticactivitywasevaluatedby96wellmicrotiterV-platesusingpurifiedtherecombinationproteinagainstsheepandbovineerythrocytesandCAMPreactionwithStreptococcusagalactiae.【Result】SequenceanalysisshowedthattheStaphylococcusaureusβ-hemolysingene(hlb)wascomposedof993nucleotidesencodingamaturepolypeptide330aminoacids;SDS-PAGEresultsshowedthattherecombinantproteinswereexpressedininclusionbodiesinEscherichiacoliwithmolecularweightof57kDandtherecombinantproteinsaccountedfor23.9%ofthewholeproteins.Thepurifiedproteinhlbhas278HU·mg-1tosheeperythrocytesand9×103HU·mg-1tobovineerythrocytes.The...

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