鳗源嗜水气单胞菌β—溶血素基因的克隆及表达VIP免费

第27卷第2期2003年4月水产学报JOURNALOFFISHERIESOFCHINAVo1．27，No．2Apr．，2003文章编号：1000—0615(2003)02—0124—07鳗源嗜水气单胞菌I]1．溶血素基因的克隆及表达龚晖，林天龙，俞伏松，董传甫，陈日升，杨金先，陈振海(福建省农业科学院畜牧兽医研究所，福建福州350003)摘要：应用PCR技术，从1株鳗源嗜水气单胞菌ML316中扩增得到溶血素基因AHL316HEM，将AHI．316HEM克隆到pGEM-TEasyVector，经分析验证后重组到pcDNA3．0中，构建了重组质粒PDLH。转化重组质粒PDLH的大肠杆菌(Escherichiacoli)DI-ISa能在血琼脂培养皿中形成明显的溶血斑，重组菌纯化的胞外产物溶血价为1．28×lO4HU·mg～，同时重组菌的胞外产物能被原始菌株的高免血清特异性地识别。结果证实，克隆到鳗源嗜水气单胞菌溶血素基因，重组质粒PDLH能够表达具有天然生物学活性的溶血素，为构建嗜水气单胞菌核酸疫苗奠定了基础。关键词：嗜水气单胞菌；溶血素基因；克隆；表达中图分类号：Q78文献标识码：ACloningand1："tgoftheP．hemolysinofI~lomngandexpressingthenemolyslngene●AeromonashydrophilastrainisolatedfromAnguiUaanguiUaGONGHui，LINTian-long，YUFu-song，DONGChuan—fu，CHENRi—sheng，YANGJin-xian，CHENZhen-hai(A，IHusbandryandVeterinaryMedicineInstitute，FlAcademyAgfSC~eS，Fu*l~u350003，China)Abstract：WiththetechnologyofPCR，thecompletedp-hemolysingeneAHL316HEMwasobtainedfromtheamplificationofallAeromonashydrophilastrainML316(isolatedfromdiseasedA池anguilla)．1hegeneWasclonedintopGEM-TEasyVector．Afteranalysis，thegeneWasinsertedintopcDNA3．0vectortoconstructtherecombinantplasmidPDLH．nIeE．colDH5awithPDLHcouldleadtoobviouse．hemolvrsisplaqueinblood-Agar．nIehemolysisactivityofcrudepurifiedtransfohnant’Sextracellularproducts(ECP)Was1．28X104HU‘mg_。．Furthermore，tlletransformant’SECPcouldberecognizedbyanti．seruiilwhichWasraisedagainstoriginalbaqterialstrain．Theaboveresultsdemonstratedthatthep-hemolysingeneofML316hadbeenclonedandtherecombinantplasmidPDLHcouldexpresstheproductwithnativebiologicalfunction．nIeSUCCESSofcloningandexpressingthep-hemolysingeneofA．hydrophilawillspe~．,dupthedevelopmentofDNAvaccineagainstA．hydrophila．Keyword：Aeromonashydrophila；p-hemolysingene；cloning；expression嗜水气单胞菌是导致鱼类暴发性疾病的主要致病菌之一[一。目前嗜水气单胞菌病的防治仍以收稿日期：2002-05．27资助项目：国家863资助(2001AA622050)~41福建省科技项目资助(2000Z077)作者简介：龚晖(1971一)，男，福建建瓯人，助理研究员，主要从事水产养殖动物病原微生物研究。Tel：0591—7817514．E-mail：ghxf@sina．corn维普资讯http://www.cqvip.com2期龚晖等：鳗源嗜水气单胞菌溶血素基因的克隆及表达125使用化学药品为主，化学药品的大量使用，导致病原菌广泛耐药，药物残留威胁着人类健康。嗜水气单胞菌病的免疫预防工作已成为鱼病学者关注的焦点，嗜水气单胞菌菌体抗原成分复杂，存在众多血清型．5J，不同地区流行的菌株在毒力和免疫原性方面差异明显，这些因素严重影响嗜水气单胞菌疫苗推广和普及L6J。进一步研究嗜水气单胞菌的毒力因子，探讨主要毒力因子在免疫保护方面的作用及其在免疫原性方面差异有助于构建高效、广谱的疫苗，有助于嗜水气单胞菌病免疫预防工作的深入开展。嗜水气单胞菌能产生多种毒力因子如：溶血素(hemolysin)、胞外酶(extracellarprotease，ECPase)、S层蛋白(S．1ayerprotein)、菌毛(pili-转铁蛋白(siderophores)及外膜蛋白(outermembraneprotein，OMP)。其中溶血素是重要的毒力因子，许多学者对嗜水气单胞菌溶血素展开广泛而深入的研究并证实溶血素同时具有溶血性、肠毒性及细胞毒性作用L1．1，对鳗鲡、鲫、小白鼠等受试动物具有独立的致病作用。我们克隆、表达了鳗源嗜水气单胞菌溶血素基因，试图在单因子水平研究p一溶血素在介导免疫保护方面的作用，同...