人血管形成素在大肠杆菌中的融合表达、纯化及活性测定VIP免费

!"卷!期#$$!年!月生物工程学报!"#$%&%’()*$+,(-.#(/%0"$(,(12%&’(!")&(!*&+,-./!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!#$$!收稿日期：#$$$0$10#2，修回日期：#$$$0$30#3。"联系作者。45’：320#6077"18"7；90:-;’：<;&"$"!=::,(5>,(?+人血管形成素在大肠杆菌中的融合表达、纯化及活性测定杨辉!"张英起!颜真!韩苇!药立波#苏成芝#（!第四军医大学生物技术中心，#第四军医大学生物化学与分子生物学教研室西安"!$$7#）摘要@40AB@获取的血管形成素C+D;&D5+;+?E)C片段，克隆入融合表达载体F@G94H中，表达产物为)端融合了I;J2的融合蛋白，以包涵体形式存在，占菌体总蛋白的!$K。用3:&’／L脲溶解包涵体，利用I;J2与过渡态金属离子);#M高亲合力结合的性质，经);#M0)4C亲和树脂一步法纯化，获得纯度达63K以上I;J20C)N融合蛋白，O5JP5.+0<’&P结果表明在相应分子量处有一条特异性条带。重组蛋白复性后活性测定表明，在体外可促进鸡胚绒毛尿囊膜（BCQ）血管形成，并可降解P@)C。关键词血管形成素，I;J2融合蛋白，配体亲和层析中图分类号@7!3文献标识码C文章编号!$$$07$2!（#$$!）$!0$$880$1肿瘤的发生、发展有赖于新生血管的不断形成，人们一直寻找来自肿瘤细胞的介导血管生长的物质，希望其能成为新的肿瘤治疗药物，从而控制肿瘤生长［!］。!638年，首次从人结肠腺癌细胞系I40#6细胞培养上清中发现了一种能诱导血管形成的物质，命名为C+D;&D5+;+（血管形成素，简称C)N）［#］。RC)N的发现引起人们极大的兴趣，但从人结肠腺癌I40#6细胞条件培养基中获取RC)N的量，不足以供RC)N生理功能、抗原特性及潜在的临床应用等方面的研究应用，为获取足够量的RC)N，我们将RC)N?E)C克隆入带有纯化标签的表达载体F@G94H，表达的目的蛋白的)端融合有I;J2［7］，便于利用金属鏊合亲和层析柱对表达产物一步纯化，获得有活性的重组蛋白，为探索肿瘤发生、发展中肿瘤血管形成的意义、机制及相应的拮抗剂的研究打下基础。!材料与方法!"!材料菌种和质粒：表达.RC)N的重组质粒F@G940C)N由本实验室构建［7］，质粒F@G94H含有4"启动子的融合表达载体，340(,#HL#!（E97）FL/GJ含有"溶原的4"@)C聚合酶基因的表达宿主菌。!"#酶和试剂限制酶，41E)C’;D-J5为NSHBT公司产品；SA4N、10氯乙萘酚为上海生工产品；);#M0)4CG5FR-.&J52H为U;-D5+产品；山羊抗人C)N多抗、及辣根酶标记的鼠抗羊的二抗为G-+P-B.,V和北京中山公司产品。!"$%&’重组质粒提取，酶切反应，E)C电泳、回收、连接、转化参照分子克隆实验手册进行［1］。!"(外源基因表达及表达产物溶解性分析构建成功的重组表达质粒F@G940C)N转化宿主菌HL#!E97（FL/GJ），挑取单克隆即为C)N的表达菌株，接种于含C:F（!$$#D／:L）的LH中，次日晨，按#K转接，7"W培养7R，加SA4N至终浓度$X8::&’／L，诱导表达!$8R，!#KGEG0ACN9，电泳，以鉴定是否有诱导产物表达。诱导表达菌悬于G49中，加入溶菌酶，1KETB，#::&’／LQDB’#，E)-J5%，搅拌片刻，1W下!#$$$.／:;+离心!$:;+，分别取上清和沉淀进行!#KGEG0ACN9。!")表达产物的亲和纯化诱导表达菌!D，冰浴，悬于8:L缓冲液H（3:&’／L脲，$X!:&’／L)-I#AT1，$($!:&’／L4.;J(B’FI3($），搅拌至清亮，!$$$$DY7$:;+离心，上清即为细菌裂解液，与!:L预先用缓冲液H平衡的);#M0)4C树脂混合装柱。依次用#Y1:L缓冲液B（3:&’／L脲，$X$!:&’／L)-I#AT1，$X$!:&’／L4.;J(B’FI2X7）洗去非特异吸附蛋白，1Y$X8:L缓冲液!（"#$%／&脲，’()#$%／&*+,-./0，’1’)#$%／&234516%7,819）及0:’18#&缓冲液;（"#$%／&脲，’()#$%／&*+,-./0，’1’)#$%／&234516%7,018），洗脱特异性结合的,45<融合蛋白，收集洗脱峰。!、;洗脱峰用)’##$%／%234516%7,"1’，’1)##$%／%;!2=充分透析-0>，收集纯化蛋白。分别取细胞裂解液、穿柱峰、洗脱峰进行)-?@!@A.=B;电泳，检测纯化产物。!"#$%&’%()*+,-’检测纯化产物纯化的蛋白进行@!@A.=B;后，C4$AD+E公司的电转移仪，将蛋白从凝胶转移至*6膜上，电转移结束后，*6膜于封闭液中封闭后，与山羊抗人=*B多抗FGH孵育->，辣根酶标记的鼠抗山羊二抗FGH孵育->，显色液中室温避光显色8#4I...