重组人P-选凝素及PSGL-1的表达与鉴定VIP免费

生理学报ActaPhysiologicaSinica,August25,2008,60(4):520-524http://www.actaps.com.cn520研究论文Received2008-05-30Accepted2008-06-30ThisworkwassupportedbytheNationalNaturalScienceFoundationofChina(No.30721065,30623003,30700409,30771960,30630036).*Correspondingauthor.Tel:+86-21-54921351;Fax:+86-21-54921435;E-mail:genglab@gmail.com重组人P-选凝素及P-选凝素糖蛋白配基-1的表达与鉴定裴新辉1,2，林志新1，耿建国2,*1上海交通大学生命科学与技术学院，上海200240；2中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所分子细胞生物学实验室，上海200032摘要：P-选凝素表达于血管内皮细胞及血小板膜上，它可以与白细胞膜表面的P-选凝素糖蛋白配基-1(P-selectinglyco-proteinligand-1,PSGL-1)相互作用，在炎症过程中介导白细胞的滚动并启动随后的白细胞迁移级联过程。我们构建了重组人野生型可溶性P-选凝素及其钙离子结合位点突变体，同时构建了重组PSGL-1免疫球蛋白融合分子(PSGL-1-Rg)，并应用昆虫杆状病毒表达系统在Sf9细胞中表达这些重组蛋白，最后用镍金属螯和柱或ProteinA亲和柱予以纯化。结果显示，用该系统表达的P-选凝素或PSGL-1是有活性的，但是P-选凝素的4个钙离子结合位点突变体却没有活性。该研究证明了P-选凝素钙离子结合位点在其与配基相互作用中的重要性。关键词：P-选凝素；P-选凝素糖蛋白配基-1；昆虫杆状病毒；昆虫细胞Sf9中图分类号：Q71ExpressionandidentificationofrecombinantP-selectinandP-selectinglycoproteinligand-1PEIXin-Hui1,2,LINZhi-Xin1,GENGJian-Guo2,*1CollegeofLifeScienceandBiotechnology,ShanghaiJiaotongUniversity,Shanghai200240,China;2LaboratoryofMolecularCellBiology,InstituteofBiochemistryandCellBiology,ShanghaiInstitutesforBiologicalSciences,ChineseAcademyofSciences,Shanghai200031,ChinaAbstract:P-selectin,oneofthemembraneproteins,expressesonplateletandendotheliaandinteractswithP-selectinglycoproteinligand-1(PSGL-1)onleukocytemembrane.Thisinteractionmediatesleukocytesrollingonendothelialmembraneandtheninducesleukocyterecruitmenttothesiteofinfectionortissueinjury.Inthepresentstudy,weconstructedtherecombinantwildtypehumanP-selectin,itscalcium-bindingsitesmutantsandrecombinantPSGL-1-globulin(PSGL-1-Rg).TheyexpressedinSf9cellsbyusingthebaculovirusexpressionsystemandwerepurifiedbyTalonTMmetalorProteinAaffinitychromatography.TheresultsshowedthattherecombinantPSGL-1-RginteractedwithrecombinantwildtypeP-selectinandtwoP-selectinmutantswith2calcium-bindingsitesmutationrespectively,butcouldnotbindtotheP-selectinmutantwithall4calcium-bindingsitesmutation.Therefore,weverifiedtheimportanceofP-selectincalcium-bindingsitesforitsinteractionwithPSGL-1.Keywords:P-selectin;P-selectinglycoproteinligand-1;baculovirus;Sf9cell选凝素家族蛋白(CD62)包括P-选凝素(P-selectin)、E-选凝素(E-selectin)和L-选凝素(L-selectin)等3种蛋白。它们是单次跨膜糖蛋白，但是在体内也有少量的可溶性选凝素蛋白。这3种选凝素分子结构类似，都是由凝集素结构域(Lectin)、生长因子样结构域(EGF)、补体调控蛋白样重复序列(P-、E-和521裴新辉等：重组人P-选凝素及PSGL-1的表达与鉴定L-选凝素分别有9个、6个和2个重复序列)、单次跨膜的穿膜结构域和胞内结构域组成。P-选凝素贮存于血小板的α-颗粒和血管内皮细胞中的韦伯氏小体(Weibel-Paladebody)中，在炎症因子或者凝血酶原的刺激下，它会迅速地通过外排作用而释放到细胞膜表面[1-6]。E-选凝素主要由血管内皮细胞表达，并分布于该细胞的细胞膜表面，但是它的表达需要炎症因子的刺激。L-选凝素组成性表达于各类白细胞的细胞膜表面[7,8]。这3种选凝素蛋白都可以通过其凝集素结构域与P-选凝素糖蛋白配基-1(P-selectinglycoproteinligand-1,PSGL-1)相互作用。PSGL-1是一种白细胞细胞膜表面的唾液酸粘...