质粒DNA的提取—碱变性提取法VIP免费

山东大学生命科学学院08级生命基地2010年10月31日星期日[质粒DNA提取][碱变性提取法][栾一][山大南路27号]质粒DNA提取-碱变性提取法质粒DNA的提取—碱变性提取法实验目的：1．掌握碱变性提取法的原理及各种试剂的作用。2．掌握碱变性法提取质粒DNA的方法。仪器和材料；恒温振荡培养箱，高速冷冻离心机，漩涡振荡器；1.5ml离心管，50ml离心管；不同型号的的枪尖等。菌体：E.coliDH5α受菌体，具有AMPr标记的质粒PUC19。实验试剂：LB培养基，抗生素，溶液I，溶液II，溶液III，RNaseA母液，TE缓冲液，饱和酚等。试验原理：碱裂解法是较常用质粒的提取的方法。其优点是收获率高，适于多数的菌株，所得产物经纯化后可满足多数的DNA重组操作。该方法操作简单，易于操作,一般实验室均可进行。十二烷基磺用于进行质粒的小量制备。十二烷基磺酸钠（SDS）是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性。用SDS处理细菌后，会导致细菌细胞破裂，释放出质粒DNA和染色体DNA，两种DNA在强碱环境都会变性。由于质粒和主染色体的拓扑结构不同，变性时前者虽然两条链分离，却仍然缠绕在一起不分开；但后者完全变性分甚至2/18质粒DNA提取-碱变性提取法出现断裂，因此，当加入pH4.8的酸性乙酸钾降低溶液pH值，使溶液pH值恢复较低的近中性水平时，质粒的两条小分子单链可迅速复性恢复双链结构，但是主染色体DNA则难以复性。在离心时，大部分主染色体与细胞碎片，杂质等缠绕一起被沉淀，而可溶性的质粒DNA留在上清夜中。再由异丙醇沉淀、乙醇洗涤，可得到纯化的质粒DNA。碱裂解法提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析等.DNA粗提取所用的三种溶液：溶液I，50mM葡萄糖/25mMTris-Cl/10mMEDTA，pH8.0；溶液II，0.2MNaOH/1%SDS；溶液III，3M醋酸钾/2M醋酸；溶液I：任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此用适当浓度的和适当pH值的Tris-Cl溶液，是再自然不过的了。加了葡萄糖后最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。因此，如果溶液I中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言，几乎没有任何影响。所以说溶液I中葡萄糖是可缺的。EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，配在分子生物学试剂中的主要作用是抑制DNase的活性，和抑制微生物生长。在溶液I中加入高达10mM的EDTA，无非就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉。如果不加EDTA，只要是在不太长的时间里完成质粒抽提，就不用怕DNA会迅速被降解，3/18质粒DNA提取-碱变性提取法因为最终溶解质粒的TE缓冲液中有EDTA。如果缺少溶液I，只要用等体积的水，或LB培养基来悬浮菌体就可以了。不过菌体一定要悬浮均匀，不能有结块。溶液II：是用新鲜的0.4N的NaOH和2％的SDS等体积混合后使用的。要新从浓NaOH稀释制备0.4N的NaOH，是为了保证NaOH没有吸收空气中的CO2而减弱了碱性。其实破细胞的主要是碱，而不是SDS，所以才叫碱法抽提法。事实上NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的相变化所导致。用了不新鲜的0.4NNaOH，即便是有SDS也无法有效溶解大肠杆菌，自然就难高效率抽提得到质粒。如果只用SDS当然也能抽提得到少量质粒，因为SDS也是碱性的，只是弱了点而已。这一步要记住两点：第一，时间不能过长，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合，不然基因组DNA也会断裂。基因组DNA的断裂会带来麻烦。溶液III：它加入后就会有大量的沉淀，大量沉淀的出现，显然与SDS的加入有关系。如果在溶液II中不加SDS会怎样呢，也会有少量的沉淀，但量上要少得多，显然是盐析和酸变性沉淀出来的蛋白质。在1％的SDS溶液中慢慢加入5N的NaCl，你会发现SDS在高盐浓度下是会产生沉淀的。因此高浓度的盐导致了SDS的沉淀。但如果你加入的不是NaCl而是KCl，你会发现沉淀的量要多的多。这其实是十二烷基硫酸钠（sodiumdodecylsulfate）遇到钾离子后变成了十二4/18质粒DNA提取-碱变性提取法烷基硫酸钾（potassiumdodecylsulfate,PDS），而PDS是水不溶的，...