血红蛋白在膜分离过程中的氧化规律和抗氧化探索VIP专享VIP免费

第5卷第6期过程工程学报Vol.5No.62005年12月TheChineseJournalofProcessEngineeringDec.2005收稿日期：2004−12−03，修回日期：2005−01−14基金项目：国家自然科学基金资助项目(编号：20136020)作者简介：石晓东(1980−)，男，河北省内丘县人，硕士研究生，生物化工专业；苏志国，通讯联系人，Tel:010-62561817,E-mail:zgsu@home.ipe.ac.cn.血红蛋白在膜分离过程中的氧化规律和抗氧化探索石晓东1,2,路秀玲1,郑春杨1,于鹏展1,索晓燕1,王永权1,苏志国1(1.中国科学院过程工程研究所生化工程国家重点实验室，北京100080;2.北京科技大学土木与环境工程学院，北京100083)摘要：脱离了红细胞的血红蛋白(Hb)在溶液中易被氧化成高铁血红蛋白(MetHb)，失去载氧活性.实验发现，当对红细胞裂解液进行微孔膜分离时，高铁血红蛋白增加不多；但在用层析法去除超氧化物歧化酶等其他红细胞蛋白后再进行超滤膜浓缩血红蛋白时，则出现较多的血红蛋白被氧化成高铁血红蛋白的现象，其氧化反应随超滤过程膜表面流体切向速度的增加而加快，随溶液温度的增加而加快.抗氧化剂的存在能有效地降低高铁血红蛋白的生成，谷胱甘肽(GSH)、半胱氨酸、N−乙酰半胱氨酸、亚硫酸钠、抗坏血酸(Vc)在溶液中和超滤过程中都能起到对血红蛋白载氧活性的保护作用.其中Vc的效果最好，最适加入量(摩尔比)Vc/Hb=8,pH8.将抗氧化的优化条件整合到从红细胞裂解液开始到超滤浓缩血红蛋白的整个流程，在离子交换层析后，添加Vc作为抗氧化剂进行超滤浓缩，Hb活性得到了很好的保护，MetHb的含量控制在2.3%，成功地制备了低MetHb含量的纯化血红蛋白.关键词：血红蛋白；膜分离；载氧活性；高铁血红蛋白；抗氧化剂中图分类号：TQ028文献标识码：A文章编号：1009−606X(2005)06−0659−061前言以血红蛋白(Hb)为基础的红细胞代用品能够缓解血源紧缺及病毒污染等问题，已成为国际研究的热点[1].膜分离是大量制备高纯度血红蛋白的重要步骤.通常血红蛋白经过微滤(MF)膜去除细胞碎片和超滤(UF)膜去除小分子杂质之后，需采用层析进一步纯化.层析后的溶液仍需用超滤浓缩更换缓冲液，以用于后续的血红蛋白修饰[2].但膜分离过程往往会造成蛋白质的失活，是一个亟待解决的问题.血红蛋白是有4个亚基和4个卟啉环的复杂蛋白质，在脱离红细胞后容易解聚成为αβ二聚体，同时卟啉环中的二价铁容易氧化成三价铁，使血红蛋白变为无载氧活性的高铁血红蛋白(MetHb).在膜分离过程中，血红蛋白溶液受到泵送或搅拌，在膜表面作切向流动，由此形成的剪切力、局部温升[3]和溶液中氧传递速度增加及溶氧量增加、蛋白与膜表面的物理、化学相互作用[4]等均不利于其活性的保持.对溶液以惰性气体保护来达到脱氧目的在膜分离过程中不容易实现，膜分离过程中蛋白质失活和抗失活的研究目前还处于探索阶段，迄今为止尚未见到有关的文献.本工作首先研究了膜分离过程中血红蛋白的氧化规律，然后考察了不同还原剂对血红蛋白抗氧化的作用，所选的还原剂包括还原型谷胱甘肽(GSH)、半胱氨酸(Cys)、N−乙酰半胱氨酸(N−A−Cys)、亚硫酸钠和维生素C(Vc).对抗氧化的过程进行了优化，探索了还原剂加入量、溶液pH值等的影响，测量了血红蛋白的载氧曲线和希尔(Hill)系数以及高铁血红蛋白的含量.2材料与方法2.1材料2.1.1原料及试剂新鲜牛血采自当地屠宰场，加入适量的柠檬酸钠抗凝.还原剂GSH,Cys,N−A−Cys为分析纯试剂，Sigma公司产品；亚硫酸钠、Vc为国产分析纯试剂，其余化学试剂均为分析纯.实验用水是由美国Millipore公司RiOs超纯水系统处理得到的超纯水.2.1.2仪器血氧分析仪HemoxAnalyzer,美国TCSScientificCorp产品.Ultraspec2000型UV/Vis紫外可见分光光度计，瑞典GEHealthcare公司产品.Φ72型pH计，美国Beckman公司产品.膜分离系统为美国Millipore公司产品，包括Labscale错流超滤系统和Pellicon2错流过滤系统.真空冷冻干燥机为美国Labconco公司产品，容量8L.G25脱盐柱为瑞典Pharmacia公司.2.1.3膜材料与规格实验选用的微滤(孔径为0.45µm,0.1m2)和超滤膜(10kD,0.005m2)均为美国Millipore公司产品，膜材料均为聚醚砜.660过程工程学报第5卷2.2实验方法2.2.1牛Hb制备牛Hb制备参考文献[...