第12卷第4期细胞生物学杂志Soc.Chem.Cd拼m“n.,517一518.[3幻aLdner,L.M.etal.,1995,aL,:g,’luir,11:375一376-[55〕Tabata,Y.et。1.,19,7,PJn.J.aC,cer双“.,88:1108一1116.[34〕aCta]do,F.,1994,aC月知n,32,437一445.荧光原位杂交技术及其应用陈乐真张杰.(解放军总医院病理科北京l。。853“上海市第五人民医院病理科上海2。。240)荧光原位杂交技术(FI“oreseeneeInSituHybridization,FxsH)是近年来生物学领域发展起来的一项新技术.其运用细胞遗传学和分子生物学的原理,作为细胞生物学和分子生物学之间的桥梁,已被广泛用于遗传疾病、肿瘤研究及临床诊断和治疗监测,有着广泛的应用前景.IFSH技术问世于70年代后期,曾多用于染色体异常的研究,近年来随着IFSH所应用的探针种类的不断增多,特别是全Cosmid探针及染色体原位抑制杂交技术的出现,使IFSH技术不仅在细胞遗传学方面,而且还广泛应用于肿瘤学研究,如基因诊断、基因定位等。原有的同位素原位杂交技术存在着较多缺点,诸如每次检测均需重新标记探针、已标记的探针表现出明显的不稳定性、需要较长时间的曝光时间和对环境的污染等.与之比较IFSH则具有①操作简便,探针标记后稳定,一次标记后可使用二年。②方法敏感,能迅速得到结果。③在同一标本上,可同时检测几种不同探针。④不仅可用于分裂期细胞染色体数量或结构变化的研究,而且还可用于间期细胞的染色体数量及基因改变的研究。本文就FISH技术特点及其应用作综述。一、FISH的技术特点FISH选用的标本可以是分裂期细胞染色体也可以是间期细胞。间期细胞可以是冰冻切片,也可以是细胞滴片或印片。生物素(Biotin),地高辛(digoxigenin),dinitrophenyl(DNP),aminoaeetylfluorene(AAF)等均可用于探针标记。前两者较为常用,通常采用切口平移法(Niektranslation)或随机引物法(RandemPirmer)对探针标记。在已知探针DNA结构及序列情况下也可采用PCR或RNA逆转录法标记探针。通常用于iBotin标记的探针应大于IO0b0p以上,这样标记易成功,这是由于DNA中dTTP含量<20肠,小于kIb以下的探针,不易标记成功.对较小的探针可采用PCR技术来标记。如探针是具有重复序列的DNA或枯粒、YAC探针,在杂交液中加上用超声断碎的人体胎盘组织DNA或CotDNA,以阻断探针和染色质之间非特异性的结合。荧光信号在高压汞灯产生的短波激发光下常引起荧光信号淬灭,为防止淬灭的发生,可将DAIP或IP稀释于P一phenlenediomine的甘油缓冲液中[,〕.任何荧光显微镜均可用于观察FISH信号,但对单拷贝探针的信号需要质量较好的荧光显微镜。如采用双色或多色滤光片可以同时观察FITC、Texas一Red等多种颜色的FISH信号,不论是染色体还是单拷贝基因的FISH信号均可用高度敏感和高分辨率的彩色胶片摄取,也可通过CCD(ehargeeoupleddeviee)的照相系统或Laserseanningeonfoealimagingsystem(激光扫描共焦成像系统)将摄取的信号储存在计算机内,经软件处理后,将信号显示在荧光屏上。由于有多种方法标记DNA探针,故一次杂交可以同时观察多个探针的信号,如两个不同的探针分别用Biotin和Digoxigenin标记,杂交后用avidin一FITC和抗一Dig一Texas一Red分别细胞生物学杂志1999年与探针上的Biotin和Digoxigenin结合,应用双色滤光片,在显微镜下就可以同时看见带有绿色荧光的IFTC和红色荧光的Texas一Red信号。同理,采用三种或三种以上不同的半抗原,如Biotin、Dig和DNP等标记探针,然后用多种不同颜色的荧光素,如IFTC(绿色),罗丹明(红色),AMA或CaseadeBlue(兰色)等结合抗体进行检测,可同时得到多种不同颜色的荧光信号,如采用不同的排列组合,最多可同时检测7种不同的探针川。由于常规的荧光显微镜的照像系统,彩色胶片不易多次曝光,限制了这种联合标记探针的应用,使用DigitalImagingCamerasystem或CeD照像系统,先分别多次摄取灰色的影像并储存在计算机内,而后冠以人为的颜色,运用软件系统融合各次得到的影像,最终形成一个复合的多颜色的图像阁。此外,对已做过G显带的染色体片子用75%酒精或甲醇褪色后,可再做IFSH,这样可更清晰的辨认各条染色体及染色体结构异常(包括某些复杂的易位,插入,倒位等)。IFSH和G显带技术结合不仅可以用新近G带处理过的片子,而且还可用陈旧的G带...
