应用PCR芯片筛查人重度肾积水组织的纤维化相关基因VIP专享VIP免费

http://www.paper.edu.cn-1-应用PCR芯片筛查人重度肾积水组织的纤维化相关基因1姚颐1，张杰1,2，叶达夫1，谭大清1，彭建平1武汉大学人民医院泌尿外科，武汉（430060）武汉大学生命科学院病毒学国家重点实验室，武汉（430070）E-mail:yivanrobin@yahoo.com.cn摘要：目的探讨纤维化相关基因,特别是与转化生长因子β（Transforminggrowthfactor-β,TGF-β）信号通路相关的基因在人重度积水肾与正常肾组织中的差异表达变化。方法收集临床重度肾积水新鲜标本12例，正常肾组织标本6例，分别提取总RNA并纯化。选择TGF-β/骨形成蛋白（Bonemorphogeneticprotein,BMP）信号通路PCR-芯片，采用比较阈值法（∆∆Ct法）分析比较两组基因的差异表达。以表达差异（即上调或下调）大于2倍的基因为有意义的差异基因。结果共筛查出表达具有显著性差异的基因49个，包括TGF-β超家族成员基因及其受体、TGF-β信号通路靶分子和相关调控分子等等。其中上调25个，包括BMP3、I型胶原α1链（Col-Ⅰα1）、Nodal、GSC、胰岛素样生长因子1（Insulin-likegrowthfactor1,IGF1）等；下调24个，包括Lefty1（Left-rightdeterminationfactor1）、BMP7、BMP2和骨形成蛋白内皮结合调节因子（BMPbindingendothelialregulator,BMPER）等。结论证明了Nodal、GSC和IGF1等是促进肾纤维化改变的重要因子，并推测Lefty1与BMP家族的部分成员，包括BMP2~3、BMP7和BMPER等，在调控终末期肾积水纤维化改变中占有重要地位。关键词：肾积水；肾纤维化；基因芯片；功能基因组学肾纤维化病变是临床常见病之一，除了肾脏自身疾病外，梗阻性肾积水的加重，也伴随肾纤维化的发展。因此，延缓肾积水引起的肾纤维化进程或逆转（减轻）肾纤维化程度，是临床外科医师在解除梗阻性肾积水病因前后都应重视的一个问题。迄今为止，人们所发现的与肾纤维化有关的信号转导通路有数十条之多。其中主要有TGF-β/Smad信号通路[1]、P38MAPK信号通路[2]、Rho-ROCK信号通路[3]及其PI-3K信号通路[4]等。越来越多的文献证明，这些通路在肾纤维化的多个环节中分别发挥着各自重要的作用，肾纤维化的信号转导机制正逐渐变得越来越清晰。但是哪一条（或几条）通路是最为关键的，各通路之间的关系如何，尚未得出令人满意的结果。本文即通过用基因芯片筛查的手段，试图从基因表达的差异谱中找到突破。1.材料与方法1.1研究对象与材料1.1.1研究对象自2005年8月至2006年12月，在我科采集因重度积水导致肾脏无功能而手术切除的肾组织标本12例、取因肾癌行肾切除的癌旁正常肾组织标本（取材位点据癌组织边缘3~5cm）6例，均保存于-70℃冰箱。经病理学检查，所有积水肾组织均表现为弥漫性纤维化改变，所有癌旁组织均表现为结构完整、形态正常的肾组织结构。经核素肾动态显像检查，所有积水肾脏的肾小球滤过率（GFR）为(18.7±3.5)ml/min，分肾功能为(7.84±1.4)%。1.1.2主要耗材与设备RT2ProfilerTMPCR芯片购于美国SuperArray公司，含113个TGF-β/BMP信号通路相1本课题得到高等学校博士学科点专项科研基金资助项目（20060486054）的资助。http://www.paper.edu.cn-2-关基因，芯片号APHS-035A。TRIZOL试剂购于Invitrogenlifetechnologies公司。RNeasy®MinElute™纯化试剂盒购于Qiagen公司，甲醛上样染液购于ambion公司，其他试剂均购于华美生物工程公司。反应平台为ABIPrism7700高通量荧光PCR系统（AppliedBiosystems）。2.研究方法2.1总RNA的提取与纯化取(50~100)mg组织样品，采用Trizol一步法提取其中的总RNA[5]，纯化过程参照RNeasy®MinElute™试剂盒说明书进行，所得总RNA和mRNA经紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳进行质量分析。2.2实时定量PCR将总RNA混合液25µl加到芯片上对应的每个孔中，小心密封芯片并置于冰上。实时定量PCR程序设置完后，将加好样的芯片置于ABIPrism7700高通量荧光实时定量PCR系统进行反应，记录检测到之反应体系中荧光信号的强度值（Ct）。2.3结果分析采用比较阈值法（∆∆Ct法）[6]，两组中每个基因的表达记为∆Ct。公式：∆Ct=平均Ct–管家基因平均Ct。每个基因表达的组间差异记为∆∆Ct。公式：∆∆Ct=∆Ct(组H)-∆Ct(组N)。其中组N是正常...