课题2多聚酶链式反应扩增DNA片段知识点一PCR原理及反应过程1．PCR的原理(1)概念：PCR是多聚酶链式反应的简称，是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，它能以极少量的DNA为模板，在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝。(2)扩增方向：总是从子链的5′端向3′端延伸。(3)引物①本质：引物是一小段DNA或RNA，它能与DNA母链的一段碱基序列互补配对。用于PCR的引物长度通常为20～30个核苷酸。②需要引物的原因：DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从3′端延伸DNA链，因此，DNA复制需要引物。(4)原理DNA的热变性原理，即双链DNA单链DNA。(5)反应条件：①一定的缓冲溶液；②DNA模板；③分别与两条模板链相结合的两种引物；④四种脱氧核苷酸；⑤耐热的DNA聚合酶，一般用TaqDNA聚合酶；⑥能严格控制温度变化的温控设备。2．PCR的反应过程(1)过程①变性：当温度上升到90℃以上时，双链DNA解聚为单链。②复性：温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。③延伸：当温度上升到72℃左右，溶液中的四种脱氧核苷酸在DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。(2)结果①PCR一般要经历三十多次循环，每次循环都包括变性、复性、延伸三步。②两个引物之间的固定长度的DNA序列呈指数扩增。注意：①可以根据基因编码序列两端的部分碱基序列来设计引物；②设计引物时，引物太短会降低PCR的特异性；③引物自身及两种引物之间不应存在互补序列；④扩增过程中，在第三轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段；⑤扩增n次后，含某种引物的DNA片段数为2n－1。细胞内DNA复制与PCR技术的比较PCR技术是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，与细胞内DNA复制的过程相比既有相同点又有不同点，通过列表比较的方法准确掌握两者的异同，是防止此类问题出错的重要措施。细胞内DNA复制与体外DNA扩增(PCR)的比较：【典题精练1】多聚酶链式反应(PCR)是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。PCR过程一般经历三十多次下述循环：95℃下变性(使模板DNA解旋)→55℃下复性(引物与DNA模板链结合)→72℃下延伸(形成新的脱氧核苷酸链)。下列有关PCR过程的叙述不正确的是()A．在PCR的变性过程中破坏的是DNA分子内碱基对之间的氢键，DNA在人体细胞内复制时可利用解旋酶实现B．复性过程中引物与DNA模板链的结合是依据碱基互补配对原则完成的C．延伸过程中需要耐高温的DNA聚合酶、ATP、四种核糖核苷酸D．PCR与细胞内DNA复制相比所需要酶的最适温度较高【答案】C【解析】变性是为了使DNA内部的氢键断裂，双螺旋打开，DNA在人体细胞内复制时借助解旋酶来实现；根据碱基互补配对原则，引物可与DNA模板链结合；延伸是形成新的DNA分子，需要以四种脱氧核苷酸为原料；PCR过程所需温度较高，会导致一般的DNA聚合酶失活，需特定的耐高温的DNA聚合酶。解题归纳细胞内参与DNA复制的组分和基本条件及其作用条件组分作用模板DNA的两条单链提供DNA复制的模板原料四种脱氧核苷酸合成DNA子链的原料酶解旋酶、DNA聚合酶打开DNA双螺旋、催化合成DNA子链能量ATP为解螺旋和合成子链供能引物RNA为DNA聚合酶提供合成的3′端起点【典题精练2】下列关于DNA复制的叙述，正确的是()A．DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从5′端延伸DNA链B．DNA复制不需要引物C．引物与DNA母链通过碱基互补配对进行结合D．DNA的合成方向总是从子链的3′端向5′端延伸【答案】C【解析】DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从引物的3′端延伸DNA链；子链是依据碱基互补配对原则，在DNA聚合酶作用下合成的，其合成方向是从子链的5′端向3′端延伸。知识点二PCR的实验操作、结果分析与评价1．实验操作(1)实验用具①PCR仪：参照下表设计循环程序。变性复性延伸预变性94℃，5min————30次94℃，30s55℃，30s72℃，1min最后1次94℃，1min55℃，30s72℃，1min提示：若无PCR仪可用恒温水浴锅代替。②微量离心管：是一种薄壁塑料管，总容积为0.5mL。③微量移液器：用于定量转移PCR反应体系配方中的液体，其上的一次性吸液枪头用一次更换一次。(2)操作步骤①准备：按照PCR反应体系的配方将所需试剂摆放在实验桌上。②移液：用...
