乳酸菌菌种的分离筛选方法乳酸细菌是一类能利用发酵糖产生大量乳酸的细菌通称。为兼性厌氧菌，杆状或球状，革兰氏阳性菌，无芽孢，不运动。营养要求高，需要提供丰富的肽类氨基酸维生素。在琼脂表面或内层形成较小的白色或淡黄色的菌落。通常用作为有益微生物的菌种有乳酸乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、粪肠球菌、乳酸片球菌、双歧杆菌、屎肠球菌、戊糖片球菌等。乳杆菌常用MRS琼脂作半选择培养基。当乳杆菌仅是复杂区系中的部分菌类时，SL培养基常用作为选择性培养基。对于芽孢乳杆菌常用GYP培养基，链球菌有TYC培养基、MS培养基。M17培养基被用作乳球菌的分离培养基。嗜酸乳杆菌属于乳杆菌属的一个种。其特性为：杆菌，两端圆，不运动，无鞭毛。粪肠球菌为革兰氏阳性，圆形或椭圆形。乳酸片球菌细胞呈球状，直径~“m,在直角两个平面交替形成四联状，一般细胞成对生,单生者罕见，不成链状排列。革兰氏阳性，不运动，兼性厌氧。在MRS培养基上菌落小,呈白色。沿洋菜穿刺线的生长物呈丝状。乳酸菌在一般琼脂培养基上形成微小菌落，不易观察，所以分离时先富集培养并选择合适的培养基。分离培养基一般添加西红柿、酵母膏、吐温-80等物质，也常常加入醋酸盐，因醋酸盐能抑制部分细菌生长，对乳酸菌无害。培养基中添加碳酸钙，乳酸溶解培养基中的碳酸钙形成透明圈，作为分离鉴别的依据，通过对生成的乳酸量进行性能鉴定。乳酸菌生长繁殖时需要多种氨基酸，维生素及微氧，一般菌落比较小。分离培养基一般可添加西红柿酵母膏油酸吐温等物质，均具有促进生长作用。也常常添加醋酸盐抑制有些细菌的生长，对乳酸菌无害。一.筛选方法：1.溶钙圈法：利用一些产酸类细菌在含CaCO3的培养基上产生CaCO3溶解圈，从而筛选出这些产酸类细菌，可用于乳酸菌的筛选。其中培养基中加入CaCO3的作用是：①鉴别能产生酸的细菌；②中和产生的酸，以维持培养基的PH。筛选过程：样品预处理一梯度稀释至10-6-选择合适的稀释度涂布-37C培养48hf挑选产生溶钙圈的菌落反复在MRS培养基上划线一挑起单菌落染色，经镜检确认为纯种一挑选革兰氏阳性单菌落一试管穿刺4C冰箱保存。2.溴甲酚绿指示剂法：培养基：MRS培养基（含溴甲酚绿酒精溶液）筛选过程：同上，不同之处是稀释涂布后长出菌落，挑取使溴甲酚绿变色的菌落。二.菌种的分离筛选1.培养基：★麦芽汁碳酸钙培养基：麦芽汁（10BX）1L预先灭菌碳酸钙5-10g/LPH自然（分离用）★★牛肉膏10g/L蛋白胨10g/L酵母膏10g/L番茄汁200g/L葡萄糖10g/L吐温%CaCO315-20g/L溴甲酚绿%（分离用）★番茄汁碳酸钙培养基：酵母膏g/L葡萄糖10g/L番茄汁100mL蛋白胨LKH2PO42.0g/L吐温mLPH（分离用）葡萄糖20g/L酵母膏10g/LPH蛋白胨8-10g/L酵母膏3-5g/L葡萄糖13-15g/LKH2PO4LMgSOg/LMnSONaACPH蛋白胨L糖蜜酵母膏3-5g/L玉米浆L44KH2PO4LMgSONaC13-5g/L葡萄糖8-10g/L4（发酵或种子培养基）★★MRS培养基（分离培养计数用）蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、柠檬酸氢二铵、葡萄糖、吐温80、乙酸钠、磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸锰、琼脂、蒸馏水IL,pH。（分离培养基），当MRS培养基冷却至45—50C时，加入已灭菌的碳酸钙,充分混匀,倒平板。BCP培养基（溴甲酚紫培养基乳糖蛋白胨酵母膏％溴甲酚紫10ml自来水1000ml（分离用）BCG牛乳营养琼脂：脱脂奶粉10g，溶于50ml水中，加入％溴甲酚绿酒精溶液，20min。另取琼脂，溶于50ml水中，加酵母膏溶解后调，Mpa20min.趁热在无菌操作下两者混合均匀,倒平板，37C培养24h，检查是否有杂菌。2.分离筛选：富集培养：取（）于无菌细□瓶中，加入无菌麦芽汁液体培养液于瓶□处，密闭，25-32C培养48h。若培养基表内出现绢丝波纹物，镜检杆状，革兰氏阳性，初步定为乳酸菌。以同样方法转接2-3次，接种量3-5%.菌种分离纯化：溶钙圈法：富集菌液或样品适当稀释至10-7，混菌法分离，先加入10-12mlMRS培养基?或麦芽汁培养基，凝固后再注入4-5ml水琼脂培养基，制成厌氧环境，30©或37C培养2-3天（温度低时间稍长），可出现针头状或圆形稍扁菌落，周围形成透明圈。挑取透明圈大，培养基变黄的菌落，反复划线纯化2-3次，所得单菌落编号，经镜检后，疑似乳酸菌落接种...
