布鲁菌脂多糖的制备及其免疫效果的初步评价VIP免费

动物医学进展。2010，31(5)：64—67ProgressinVeterinaryMedicine布鲁菌脂多糖的制备及其免疫效果的初步评价德育慧1，王枫1，赵忠鹏2，王希良2(1．第四军医大学预防与公共卫生教研室，陕西西安710032，2．军事医学科学院微生物与流行病学研究所，北京100070)摘要：为研究布鲁茵的一个毒力因子脂多糖的免疫保护效果，采用冷酚法提取脂多糖，并用凝胶过滤层析法对其进行纯化，采用滴鼻免疫和皮下注射两种途径免疫Balb／c小鼠，进而检测血清IgG抗体效价和脾中细胞因子IFN一7的分泌情况。通过上述实验最终制备了较纯的脂多糖，以皮下注射10l上g组血清IgG抗体效价最高，由此证明LPS具有一定的免疫原性。关键词：布鲁茵；脂多糖；滴鼻免疫；皮下注射中图分类号：$852．614文献标识码：A文章编号：1007—5038(2010)05—0064—04布鲁菌病(Brucellosis)简称布病，是由布鲁菌属(Brucella)细菌感染引起的世界范围内的重要人兽共患传染病[1]，主要引起牛、羊、猪和骆驼等家畜流产不育以及人类波状热病，严重地危害畜牧业发展和人类的健康。布病在我国有着广泛的流行区域，尤其在以畜牧业生产为主的地区。流行中占绝对优势的是羊布鲁菌病，其次为牛布鲁菌病。据报道，我国每年新发布病病例达几万人次，牛、羊、猪感染有百万头(只)之多，所造成的经济损失达十几亿元[2]。自20世纪末，布病在国内外又出现了再度肆虐的势头，引起人们的广泛关注和重视。究其原因，主要有以下几个方面：①布病是一种国家法定的二类传染病心]，也是潜在的生物战剂和生物恐怖剂，始终受到各国首脑和军事医学家的高度重视；②布病在世界范围内，特别是发展中国家仍无法根除，目前只有英国和澳大利亚通过严格的卫生防疫措施消灭了本国的布病‘引。自发现布鲁菌病病原菌后，人类就试图以疫苗预防人畜布病。布病疫苗发展较早，而且种类繁多，主要有传统的减毒活菌苗、死菌苗、化学苗、新型疫苗四种。应用较早迄今仍占重要地位的是传统的减毒活菌苗，此外，近几年出现的化学苗和新型疫苗也越来越受到重视。脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)是革兰阴性菌的一种组成部分，在某个特定的免疫反应，脂多糖分子本身能够赋予某些肠道致病菌免疫保护[4]。本研究中以Balb／c小鼠为动物模型，从布鲁菌中提取的脂多糖，对两种不同途径接种后脂多糖的免疫效果进行了初步评价。1材料与方法1．1材料1．1．1茵种布鲁菌M5活疫苗，购自新疆天康畜牧生物技术股份有限公司。1．1．2试验动物SPF级条件下饲养的Balb／c小鼠，雌性，体重18g～22g，由军事医学科学院实验动物中心提供。1．1．3培养基胰蛋白大豆培养基、肉汤培养基为上海碧迪医疗器械公司产品。1．1．4抗体、疫苗和标准品HRP标记的抗小鼠IgG、IgA二抗、LPS标准品(12038，10mg)均为Sig—ma公司产品；布鲁菌104M疫苗为新疆天康畜牧生物技术股份有限公司产品。1．1．5试剂和仪器苯酚、三氯化铁为北京化学试剂公司产品，SephadexG50、凝胶电泳系统为Pha—marcia公司产品。冷冻高速离心机为Beckman公司产品，紫外分光光度计(Ultrospec3000)为德国公司产品。1．2方法1．2．1细茵培养无菌条件下将布鲁菌M5接种于大豆胰酶琼脂斜面培养基，置体积分数为5％CO：培养箱中，37℃培养2d后菌落长出，挑选光滑型菌落接种于营养肉汤培养基，72h后离心收获菌体。1．2．2LPS提取将1．2．1中收集的菌体用无菌去离子水制成均匀悬液，以4000r／min离心15min收稿日期：2009—11一02作者简介：德育慧(1975一)，女，黑龙江讷河人，硕士研究生，主要从事预防医学研究。万方数据德育慧等：布鲁菌脂多糖的制备及其免疫效果的初步评价65后，洗涤1次。测湿重，每10g加160mL灭菌蒸馏水悬浮，置一70℃冻融3次。4℃下加750mL／L苯酚265mL，充分振荡1h。4000r／min离心30min。离心后分为水层、蛋白层，酚层、菌体层这4层，分别吸取水层和酚层，放入透析袋中流水冲洗透析至无酚。(10g／L三氯化铁检验，呈紫色为阳性)浓缩至原量的1／3后，1500r／rain离心30min，吸取上清液。加入2倍～6倍体积的950mL／L乙醇，振荡。置一20℃冰箱保存。4000r／min离心30min，沉淀的LPS中加入少量灭菌双蒸水至完全溶解。冷冻后即为LPS粗提品...