c曲t础SouthPharmacy】u眦2004，v01．2No．3中南药学2004年6月第2卷第3期蛋白质的化学合成黄永东1，韩彦丽2，甘一如¨(1．天津大学化J二学院，天津300072；2．大连理工大学精细化工国家重点实验室，大连116012)中图分类号：TQ464．7文献标识码：A文章编号：16722981(2004)03016404蛋白质是生物体中功能最重要的一类生物大分子，目前蛋白质的制备方法主要有3种：生化提取法、基凶T程法和化学合成法“]。各种方法利弊并存”叫]，没有一种方法能够完全适用于所有蛋白质的制备。生化提取法来源少，基因工程法翻译后难以修饰．易形成包合体等不恰当的折叠构型；相比之下，化学合成法提供了一条快速、高效的蛋白质制备途径，同时它能方便地引入非天然氨基酸，政变碳链骨架以及其他化学修饰来提高蛋白质活性，构建新蛋白。经过30多年的发展，蛋白质的化学合成取得巨大的进步，逐步合成法、片段组合法、化学选择性连接作用、非共价定向拼接的依次出现．大大推动了蛋白质化学合成向纵深方向发展。蛋白质的全合成不仅具有重要的理沦意义，而乍L具有相当重要的应用价值。1两种氨基保护策略目前应用在化学合成上主要有两种方法：Boc(叔丁氧羰基)口一“传统固相法和Fmoc(芴甲氧羰基)口”新型固相法。Boc化学合成法是一种历史较长也较成熟的方法。相比之下，Fmoc法历史较短，但具有条件温和、副反应少、产率高、操作简便等优点，其优越性止在逐渐为人们所认识，已被广泛应用于柞种活性分了的合成。Fmoc法最大的优点是不需要采用剧毒的氢氟酸将日标蛋白从固相载体上裂解下来并脱除侧链保护基，而是采用三氟乙酸水苯酚二巯基乙烷苯甲硫醚(82．5：5：5：5：2．5)定量地从树脂上切除，避免了采用强酸如液态氟化氢可能产生的氨基酰化等副反应。2蛋白质化学合成的基本方法2．1逐步合成法E4,s-r]逐步合成法是最早发展起来的化学合成蛋白质的方法．它的基本原理是根据目标蛋白的氨基酸序列(‘级结构)，从C端．(或N端)依次逐个偶联各个氨基酸柬合成蛋白质。逐步合成最大的特点是简单明了，但是它合成蛋白质的能力高度依赖于各步的合成效率。最近4年来，本实验室对胸腺素衄和扶素康的逐步化学合成进行了大量的研究“～⋯。特别是对胸腺素劬，系统研究了不同的缩台试剂，包括Ix、c、D1C、HBTU、HATU对合成速度和产物质量的影响，为胸腺素n，的进一步产业化提供了依据。数十年来，化学合成取得了可喜的进步，但是，合成速度一直是摆在人们面前的一个严峻挑战，特别是合成那些由上百个氨基酸组成的目标分子。一般地，根据保护方法和偶联策略的不同，每个氢基酸的偶联需要20～120rain，如果是“困难序列’’。-1的合成，那就需要2倍甚至3倍的偶联时间，才能达到可以接受的酰化产率。快速合成法“”1的出现，满足r人们一直所追求的偶联10--15个氨基酸·h“的日标。固相载体卜的快速合成由脱保护、排空、冲洗偶联的重复循环过程组成(见罔1)。由图l可见，整个循环时间不到5min，一直重复该循环直到合成完目标分子。成功地高产率合成“困难片段”ACP(10～15)，PnlA(A10L)和PR(81～99)，平均产率分别为99．2％、99．4％和97．9蹦”一，证明了该方法的快速性和有效性。总的米说，快速合戚法具有以下几方面的优点：①快速鉴定目标分子的“困难序列”；②快速台成小而复杂的肽；③快速合成蛋fE_i质及其突变体，以便于短期内对结构功能关系进行更深入的研究；④快速合成用于化学选择性连接构建目标蛋白的肽片段。茚三酮定性检【---．-----．—-．．．．，-—．．．．．——．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．_一。4．8min循环图l快速合成法示意图尽管快速合成法的效果十分显著。但是仍有几个方面的问题限制了它的广泛应用：①HATU价格昂贵；②还无法有效将快速HATU／Boc原位中和偶联应用到自动合成仪中。因此，将来很有必要进一步发展比HATU更加便宜有效的替代偶联试剂和研究设计适用于快速合成法的新一代自动合成仪。2．2片段组台法口7“1虽然固相多肽合成(solidphasepeptidesynthesis，SPPS)与经典的液相法相比具有许多优越性，但固相法也有其不可避免的问题存在，即...
