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一、实时荧光定量PCR原理(一)定义:在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。(二)实时原理1、常规PCR技术:对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准确定量,无法对扩增反应实时检测。2、实时定量PCR技术:利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化,通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析3、如何对起始模板定量?通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析.4、几个概念:(1)扩增曲线:(2)荧光阈值:(3)Ct值:CT值的重现性:5、定量原理:理想的PCR反应:X=X0*2n非理想的PCR反应:X=X0(1+Ex)nn:扩增反应的循环次数X:第n次循环后的产物量X0:初始模板量Ex:扩增效率5、标准曲线6、绝对定量1)确定未知样品的C(t)值2)通过标准曲线由未知样品的C(t)值推算出其初始量7、DNA的荧光标记:二、实时荧光定量PCR的几种方法介绍方法一:SYBRGreen法(一)工作原理1、SYBRGreen能结合到双链DNA的小沟部位2、SYBRGreen只有和双链DNA结合后才发荧光3、变性时,DNA双链分开,无荧光4、复性和延伸时,形成双链DNA,SYBRGreen发荧光,在此阶段采集荧光信号。PCR反应体系的建立及优化:1、SYBRGreen使用浓度:太高抑制Taq酶活性,太低,荧光信号太弱,不易检测2、Primer:引物的特异性高,否则扩增有杂带,定量不准3、MgCl2的浓度:可以降低到1.5mM,以减少非特异性产物4、反应Buffer体系的优化5、反应温度和时间参数:由酶和引物决定6、其他与常规PCR相同(二)应用范围1、起始模板的测定;2、基因型的分析;3、融解曲线分析:可以优化PCR反应的条件,对常规PCR有指导意义,如对primer的评价;可以区分单一引物、引物二聚体、变异产物、多种产物。(三)优点及缺点优点:对DNA模板没有选择性;适用于任何DNA;使用方便;不必设计复杂探针;非常灵敏;便宜。缺点:容易与非特异性双链DNA结合,产生假阳性;但可以通过融解曲线的分析,优化反应条件;对引物特异性要求较高。方法二:TaqMan---水解型杂交探针**5′端标记有报告基团(Reporter,R),如FAM、VIC等**3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher,Q)**探针完整,R所发射的荧光能量被Q基团吸收,无荧光,R与Q分开,发荧光**Taq酶有5′→3′外切核酸酶活性,可水解探针(一)工作原理注意:每扩增一条DNA分子,释放一个荧光信号,可以在循环过程中任一点检测荧光PCR反应的建立:1、引物、探针的设计:探针Tm为68-70℃,<30bp,5’不能有G,G可能会淬灭荧光素,引物尽量靠近探针,扩增片段<400bp,引物Tm为59-60℃2、反应参数的确定:一般为:94℃,10-20S60℃,30-60S(Taq酶5′→3′外切核酸酶活性在60℃最高)也可通过温度梯度优化退火温度72℃,45S,3、优化引物和探针浓度:获得最小Ct值,信号/背景比值的最大值引物浓度:50-900nM探针浓度:50-250nM4、其他与常规PCR相同(二)优缺点优点:对目标序列的高特异性------阴性结果确定设计相对简单------与目标序列某一区域互补重复性比较好缺点:只适合一个特定的目标;委托公司标记,价格较高;不易找到本底低的探针

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