实验一：线虫RNA干扰的基因沉默一、实验目的RNA干扰(RNAinterference,RNAi)是一种使基因使失活的有效方法，在线虫中，RNA干扰因为简单而成为研究基因功能的有效手段。我们利用表达tag-214dsRNA的大肠杆菌喂食线虫来介导RNAi,以达到鉴定tag-214基因功能的目的。二、实验背景RNAi是近年来以秀丽线虫的研究为基础而发展起来的一种基因knockdown技术，将体外合成的含有目的基因的dsRNA通过某种方式引入到线虫体内，导致其体内相应的目的基因mRNA降解，从而达到基因沉默的目的。三、实验原理通过显微注射dsRNA或者把线虫浸入到含有dsRNA的溶液中，或者用能够表达dsRNA的大肠杆菌喂食线虫，可以将dsRNA导入大肠杆菌中。在大肠杆菌HT115中，含有目的基因发夹结构的质粒，在IPTG的诱导下转录出正义和反义的RNA,两条RNA链通过退火形成dsRNA。当线虫以此大肠杆菌为食时，就摄取了大肠杆菌合成的dsRNA，并触发了线虫体内RNA干扰的发生。本实验将利用表达tag-214dsRNA的大肠杆菌喂食线虫来介导RNAi，以达到鉴定tag-214基因功能的目的四、实验材料：1.秀丽线虫(C.elegans)rrf-3突变体(RNAi敏感型)由于线虫的RNA的干扰操作简单快速，且重复性好，已成为鉴定基因功能以及基因间互相作用关系的有效材料。秀丽线虫属于线性动物门，线虫纲，小杆线虫目，广杆线虫属。秀丽线虫是一种生活在土壤中的线虫，长约1mm,直径70um,由959个细胞组成。秀丽线虫具有雌雄同体和雄性个体两种性别。雌雄同体的线虫有两条X染色体和5对常染色体。其基因组大小为80Mb，包含13000个基因。图为秀丽线虫的生活史。线虫具有生活周期短，易培养和保存等优点，由于其身体透明，因此可以IAHE=*HVM-t'l4出KsOsC.!«ja'E-HU-fiZi^lTTi■t□rcx-c-XXhermaphrodite在显微镜下跟踪观察每个细胞的命运，是目前遗传学、发育学和细胞生物学研究的重要模式生物。2.大肠杆菌野生型菌株OP50菌株OP50是一种尿嘧啶缺陷型大肠杆菌，它涂布于NGM培养基上，由于该种大肠杆菌是尿嘧啶缺陷型，只能从NGM中获取尿嘧啶，无法自身合成。所以生长速度会比普通的大肠杆菌慢很多，这样既可以提供线虫食物，又不会过度生长。如果用普通的大肠杆菌，由于没有限制，会过度生长，而且湿度，氧气已经各种环境因素会制约线虫的生长。3.带有tag-214发夹结构质粒的HT115菌株将构建好的质粒转入大肠杆菌HT115,在IPTG诱导下成功获得目的基因对应的双链RNA。五、实验试剂：1.NGM普通固体培养基（1L配方）NaCl3.0g细菌蛋白胨16.0g蒸馏水1.0L琼脂16.0g1mol/LMgSO41.0ml1mol/LCaCl21.0mlNaCl1%高压灭菌后加入下列溶剂（每组分配以上溶液250ml）胆固醇250匹1mol/L磷酸钾缓冲液6.25ml配方（1L）KH2PO4129.25gK2HPO451.75g2•含有氨苄青霉素和IPTG的NGM固体基（用于RNAi）（1L配方）NaCl3.0g细菌蛋白胨2.5g蒸馏水974ml酵母提取物0.8g琼脂17.0g1mol/LMgSO441.0ml1mol/LCaCl221.0ml高压灭菌后加入下列溶剂（每组分配以上溶液250ml）胆固醇250匹1mol/L磷酸钾缓冲液6.25ml配方（1L）KH2PO4129.25gK2HPO451.75g1mol/L氨苄青霉素1.2mlIPTG的终浓度达到4mmol/L3.LB液体培养基（1L配方）牛肉膏蛋白胨1%酵母提取物0.5%加蒸馏水补足1L4.M9缓冲液(1L配方)Na2hpo45.8gKH2PO43.0gNacl1.0g蒸馏水1.0L5.氨苄青霉素和四环素抗生素氨苄青霉素(100mg/ml)四环素(100mg/ml)六、实验器材：天平实体显微镜酸度计水浴锅超净工作台灭菌锅恒温摇床恒温生化培养箱常温台式离心机七、实验步骤第一天i.配制实验试剂，并在超净工作台中配制NGM固体培养基和用于用于RNAi的NGM固体培养基.ii活化大肠杆菌OP50,挑取少量菌于3mlLB液体培养基内，37°C震荡培养20h左右.第二天i.铺菌，将200«L的OP50菌液接入到60nm的NGM平板中央，顺时针方向晃动平板使菌液尽量均匀分布在平板上，室温下放置干燥.ii.活化大肠杆菌HT115，方法同上，将control和带有tag-214基因的分别做好标记.第三天i.将10-20只rrf-3突变体的线虫接到铺有OP5O的NGM平板上，在培养皿盖侧面标上线虫名称和日期，然后被放入到温箱中，20°C恒温培养.ii•再次活化HT115菌体，即从之前活化的菌液中control和tag-214的分别取30«L菌液加入到3mlLB液体...
