细胞生物学综合性实验课程名称:细胞生物学实验姓名:李春辉班级:12级生科（1）班学号:2012041106时间:植物原生质体的分离、纯化及融合引言原生质体是去除了细胞壁被质膜所包围的、具有生活力的/裸露细胞,对它的研究,可追溯到20世纪60年代英国植物学家Cocking[1]用酶解方法降解细胞壁,获得了番茄根尖原生质体,自此原生质体的研究得到迅速的发展.1970年Nagata和Takeble[2]首次报道烟草叶肉原生质体经分离、培养得到再生植株.Carlson[3]于1972年利用原生质体融合技术从烟草中获得第一个种间杂种,可部分克服有性杂交不亲和性,获得体细胞杂种,从而为创造和选育优良品种找到了一条新途径.近年来,由于原生质体本身所具有的特点及其培养技术与有关的细胞、分子和遗传等学科的交叉渗透,使植物原生质体的研究越来越受到重视.研究领域也从分离原生质体进行的生理生化和利用不同材料的原生质体得到再生植株的阶段转到原生质体的应用(尤其是遗性状改良)方面.前人的研究表明,原生质体不仅可以作为一个单细胞系统来研究细胞壁再生、细胞分裂与分化、摄入细胞器、病毒侵染机理、膜透性及离子转运等基础理论研究的理想材料;而且,近年来以原生质体为材料利用膜片钳技术研究离子通道及原生质体在受光、胁迫和激素作用后的调剂机制已经成为人们所热切关注的问题.与此同时,原生质体也被用来作为研究植物细胞钙信号转导及其调节机制的理想材料[4,5].现在人们对利用原生质体导入外源基因及原生质体瞬间表达系统在基因研究中的应用进行了大胆的尝试和实践,目前已经建立对芹菜、玉米、胡萝卜、拟南芥和烟草等植物对不同的外界刺激下信号转导机制的研究[6].这对植物遗传转化、性状改良等方面都具有深刻的指导意义[7,8].选择分离原生质体的适宜材料是分离原生质体成功的关键[9],主要包括基因型、材料的类型及材料的生理状态等3个方面.基因型直接影响原生质体的分离培养效果.不同基因型分离的原生质体产量和活力差别很大[10],并直接影响原生质体植株再生[11,12].同时起始材料及其生理状态对原生质体的制备和活力的影响也很大[13].叶片可以得到大量比较均一的原生质体且不使母细胞受到破坏,许多资料报道双子叶植物分离原生质体的最佳材料是叶片[14].此外,子叶、胚轴、茎尖及愈伤组织、悬浮培养物和体细胞胚等均可作为分离原生质体的材料.在木本植物中,愈伤组织或细胞悬浮物是应用最广泛的原生质体培养材料[15].但是,采用愈伤组织和细胞悬浮物往往需要经若干次的继代培养才能达到适合分离原生质体的状态;而继代时间的长短在很大程度上影响所获得原生质体的活力和产量[16].原生质体的分离方法有机械法和酶解法两种。机械分离法是19世纪末由Klercker首创的,其主要缺点是收获量太小,但具有防止酶对原生质体产生副作用的优点。酶解分离法的优越性是能得到大量有活力的原生质体。由于目前普遍采用的是酶解分离法,所以本实验也采用酶解法。其原理是根据由纤维素酶、果胶酶和半纤维素酶配制而成的溶液对细胞壁成分的降解作用，而使原生质体释放出来。由于酶制剂中常含有核酸酶,影响原生质体的活力,可以用降低保温温度或减少酶解时间,提高原生质体的活力.实验证明在原生质体分离的混合酶液中加入一定量的CaCl2.2H2O、KH2PO4具有保护膜的作用[17],加入适量的PVP或MES能稳定酶解过程的pH值[18].通常用甘露醇、山梨醇、葡萄糖来调节酶液的渗透压.W.巴尔茨(1983)等[19]认为,代谢活跃的渗透压稳定剂(葡萄糖和山梨醇)与代谢不活跃的渗透压稳定剂(甘露醇)一起使用有利于维持酶液的渗透压.酶解是在25~28e的恒温下黑暗或弱光下进行的.酶解后经过400目左右的镍丝网过滤,滤去消解不完全的组织碎块(导管、筛管等)和细胞团.然后将滤液离心,弃去上清液,将离心下来的原生质体重新悬浮在洗液(CPW)中,再次离心,去上清液,重复3次.在倒置显微镜下检查纯化效果,效果好,用原生质体培养基离心,效果不好,用质量分数为20%的蔗糖离心,使完整的原生质体浮于液面.原生质体融合(protoplastfusion),亦称细胞融合(cellfu-sion)﹑体细胞杂交(somatichybridization)﹑超性杂交(para-sexualhybridization)或超性融合(parasexualfusion),是指不同种类的原生质...
