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1/9实验一食品中细菌总数的检验一、实验目的要求1、了解细菌总数检验的意义。2、掌握样品稀释处理的方法和菌落总数计数的方法3、掌握国标法测定菌落总数的方法和技能4、熟练无菌操作技术。二、原理菌落总数是指食品经过处理，在一定条件下培养后，所得1g或1ml检样中所含细菌菌落总数。菌落总数主要作为判别食品被污染程度的标志，也可以应用这一方法观察细菌在食品中繁殖的动态，以便对被检样品进行卫生学评价时提供依据。菌落总数并不表示样品中实际存在的所有细菌总数，菌落总数并不能区分其中细菌的种类，所以有时被称为杂菌数，需氧菌数等。三、试剂和仪器（一）最先准备的器材（清洗、烘干、包扎、灭菌）规格名称1、500ml广口瓶2、500ml三角瓶3、250ml三角瓶4、18×180mm试管5、1ml移液管数量1个2个3支5支倒营养平板用途稀释样品配制生理盐水配制营养琼脂稀释样品6、直径为90mm平皿10套7、250ml量筒1支2/98、玻璃珠：直径约5mm（二）应灭菌、消毒的器材剪刀1把不锈钢药匙1把称量纸：适量酒精消毒的器材：吸耳球1个，滴管胶头4只，开瓶器（三）应制备的培养基总量所用容器500ml三角瓶250ml三角瓶1、0.85%NaCl生理盐水1瓶300ml/瓶2、平板计数琼脂（PCA）培养基：2瓶100ml/瓶四、实验内容（一）、基本操作过程：样品称量→→样品稀释→→倾注平皿→→培养48小时→→计数报告。（二）、样品的稀释（样品的处理）样品：袋装乳粉外包装消毒→→无菌称样品25g→→加无菌生理盐水→→加盖振荡摇均匀1、用75%酒精棉球擦拭消毒袋口，用无菌剪刀开封取样。称取检样25g，放入装有适量玻璃珠的灭菌广口瓶子中，然后用225mL温热的灭菌生理盐水徐徐加入（先加入少量生理盐水将乳粉调成糊状，再全部加入，以免奶粉结团），采用振摇法（用力快速振摇50次,振幅不小于40cm）振摇均匀，即为1：10的稀释液。固体检样在加入稀释液后，最好置灭菌均质器中以8000~100r/min的速度处理1min，制成1：10的均匀稀释液。3/92、用1ml灭菌吸管，吸取1∶10稀释液1ml，注入含有9ml灭菌生理盐水的试管内，振摇试管混合均匀，制成1∶100稀释液。3、另取1ml灭菌吸管，按上项操作顺序作10倍递增稀释液，如此每递增稀释一次，即换用另一支1ml灭菌吸管。4、根据对检样污染情况的估计，选择2～3个适宜稀释度，分别在作10倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的稀释液1ml于灭菌平皿内，每个稀释度做2个平皿。5、用1ml生理盐水作空白对照试验，做2个平皿。注意：①吸管尖端不要触及瓶口或试管口外部，也不得触及管内稀释液。②吸管插入检样液内取样稀释时，插入深度要达2.5cm以上,调整时应使管尖与容器内壁紧贴。③进行稀释时，应使吸管内的液体沿管壁小心流加入，以免增加检液。④每递增稀释一次，即换用一支1ml灭菌吸管。（三）、倒平板稀释液移入平皿后，应及时将凉至46℃的营养琼脂培养基（放置于46℃水浴保温）倾注入平皿约15ml，并转动平皿使混合均匀。注意：①培养基不能触及平皿口边沿，加入培养基后可正反两个方向旋转，但不可用力过度，以免溅起触及上盖。②检样从开始稀释到倾注最后一个平皿，所用时间不宜超过20min。（四）、培养待琼胶凝固后，翻转平皿，置36±1℃温箱内培养48h后取出，立即计算平皿内菌落数目，乘以稀释倍数，即得每克（每毫升）样品所含菌落总数。4/9注意：（1）（2）琼脂凝固后，就立即将平板放入培养箱内进行培养，以免细菌蔓延生长。如果把不能立即计数，要将平板放入0～4℃冰箱中，但不能超过24h。不同产品菌落总数测定的培养时间：肉、乳、蛋及制品：37℃培养48h水产品：30℃培养48h：清凉饮料、调味品、糕点、果脯、酒类等：37℃培养24h五、结果报告1、平皿菌落数的选择（1）选取菌落数在30～300之间的平板作为菌落总数测定标准。每一个稀释度应采用两个平皿，大于300的可记为多不可计。（2）其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，则可以计算半个平板后乘以2，以代表一个平板的菌落数。（3）当平板上有链状菌落生长时，如呈链状生长的菌落之间无任何明显界限，...