MSI检测技术VIP专享VIP免费

MSI检测技术微卫星简要介绍现用微卫星检测技术流程多重荧光PCR技术概略介绍毛细管电泳概略介绍微卫星检测的临床检测可行性MSI检测技术摘要MSSimplerepeatsequencesof1to6basepairs单核苷酸型:AAAAAAAA..双核苷酸型:ATATATAT..三核苷酸型:ATCATCATC..…….MSPronetoreplicationerrorsDefectionofMMRMSinstabilityLSSporadicMSILSMS错误产生机制Stutter又被称为影子带，或者DNA聚合酶滑脱产物。表现为PCR产物比主要扩增产物增加或减少一个或几个重复单位。MSIMAKERSINLSNationalCancerInstitute–sponsoredworkshopin19972mononucleotiderepeats(BAT25andBAT26)3dinucleotiderepeats(D2S123,D5S346,andD17S250)Revisedin20025mononucleotiderepeats(BAT25,BAT26,NR-21,NR-22,andNR-24)PromegaMSIAnalysisSystem5mononucleotiderepeats(BAT25,BAT26,MONO-27,NR-21andNR-24）2pentanucleotiderepeats(Penta-CandPenta-D)criteriaMSI-HReplicationerrors≥2makersMSI-L1MSS0实验流程1、基因DNA的提取2、多重荧光PCR3、毛细管电泳检测4、分析数据基因DNA的提取流程Promega试剂盒法分别挑选正常、肿瘤组织显微切割多重荧光PCRDiseaseMarkers20(2004)237–250JefferyW.Bacher,LauraA.Flanagan上游引物的5’端作荧光标记JOE~GreenFL~BlueTMR~Black多重荧光PCRPCR反应体系（25μl）：2.5µlGoldSTR10XBuffer★0.1-1µMeachprimers0.05µlAmpliTaqGoldDNAPolymerase(5Units/µl)1-2ngDNAPCR条件：1cycle95◦Cfor11minutes;1cycle96◦Cfor1minute;10cycles94◦Cfor30sec-onds,ramp6secondsto56◦C,holdfor30seconds,ramp50secondsto70◦C,holdfor45seconds;20cyclesat90◦Cfor30seconds,ramp60secondsto56◦C,holdfor30seconds,ramp50secondsto70◦C,holdfor45seconds;60◦Cfor30minutesfinalextension;4◦Chold.DiseaseMarkers20(2004)237–250JefferyW.Bacher,LauraA.Flanagan毛细管电泳检测、分析微卫星位点经过荧光标记PCR扩增后，取适量PCR产物、分子内标(ILS600)溶于缓冲液（甲酰胺）中经遗传分析仪毛细管电泳进行扫描，通过检测片段长度来判断微卫星不稳定性。利用Genescan和Genetyper软件进行图像收集和分析，计算出微卫星等位变异扩增片段的大小。PromegaMSIAnalysisSystem,Version1.2横坐标代表片段长度纵坐标代表荧光强度多重荧光PCR优点多重PCR技术是指在一个单一反应体系中加入一对以上的特异引物对，同时扩增多个序列，从而产生高度特异性的反应过程，该技术对DNA模板要求量小、高通量分析且省时、省力、省材。应用不同荧光标记可以解决不同PCR扩增位点长度的重叠，极大的提高效率。多重荧光PCR前提条件所有引物对的退火温度必须接近；在同一反应体系中，所有引物对之间不能有相互作用（形成引物寡聚体）；同色引物扩增产物应长度有别，这样才可同时对多个位点进行片段分析。毛细管电泳清洗毛细管更换电泳缓冲液进样电泳并同时在线检测操作步骤毛细管电泳优点荧光标记毛细管电泳(FCE)—快速、准确、敏感性强、可重复性好、结果易分析、高通量检测、客观性强聚丙烯凝胶电泳加放射显影或银染(传统方法）—费时、步骤繁琐、判断结果主观性较强MSI直肠癌的临床检测可行性99%con-cordancewithIHCNearly100%accuracyLowercostbacauseoftheuseofasinglemultiplexfluorescentMSIassayFindoutthosemisclassifiedonlybasedonIHC(about5%MSI-HtumorshadnormallevelsoffourMMRproteins)DiseaseMarkers20(2004)237–250JefferyW.Bacher,LauraA.Flanagan关于突变的一些概念Germlinemutation：由父母传给后代的突变，由于此种突变发生在精细胞和卵细胞中，故称为生殖系突变。Consititutivemutation:突变发生在配子或合子过程中，并且这种突变在合子分裂过程中得以保留，导致个体所有组织、所有细胞均含有突变。Mosaicmutation：突变发生在合子分裂之后的胚胎早期（几个细胞或几十个细胞），若其中一个细胞含有突变，那么由此细胞分裂形成的组织/器官就会携带此突变（如果不涉及生殖细胞则称为体细胞镶嵌突变）。