实验五、氨基酸的分离鉴定--滤纸层析法VIP免费

实验一、氨基酸的分离鉴定实验一、氨基酸的分离鉴定——纸层析法一、实验目的一、实验目的通过氨基酸的分离，学习纸层析法的基本原理及操作技术。二、实验原理二、实验原理纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法。利用不同物质在两种互不相溶的溶剂中的分配系数不同而得到分离。展层剂由有机溶剂与水组成。在纸上，水被吸附在纤维素的纤维之间形成固定相，当有机相沿纸流动经过层析斑点时，层析点上的溶质就在有机相和水相之间进行分配。当有机相不断流动时，溶质就沿着有机相流动方向移动，不断进行分配，溶质中各组分的分配系数不同，移动速率不同，因而彼此分开。各组分由于移动速度不同，物质被分离后在层析纸上的位置也不同，可用Rf值来表示：原点到层析点中心距离Rf＝———————————原点到溶剂前沿的距离在一定的条件下某物质的Rf值是常数，可作为定性分析的依据。Rf值大小与样品物质的结构性质、溶剂系统、层析滤纸的质量及展层方式、温度、样品溶液中的杂质等因素有关。物质结构与性质物质结构与性质物质的极性大小决定了物质在水和有机相之间的分配情况，其极性的大小主要取决于物质所具有的极性基团的性质和数量，在极性基团不改变情况下，非极性基团成分越多，则分子极性越低等。展层方式展层方式上行法下行法环形法(辐射法）三、器材三、器材层析缸、毛细管、喷雾器、培养皿、层析滤纸四、试剂四、试剂1、扩展剂：按体积4:1:3的正丁醇：冰醋酸：水混合后倒入分液漏斗中，充分振荡，静置后分层排出水相50ml/组2、平衡剂：取漏斗中的扩展剂5ml于烧杯中作平衡剂。3、氨基酸：0.5%赖、脯、缬、苯丙、亮氨酸溶液及各组分的混合氨基酸各5ml。4、显色剂：0.1%水合茚三酮正丁醇溶液。200ml全班五、操作五、操作1、取层析滤纸一张，在纸的一端距边缘2-3cm处用铅笔画一条直线，在此线上每间隔2cm作一记号（即原点）如图。2、点样：用钢笔或毛细管将氨基酸样品分别点在这6个位置上，干后再点一次。每点在纸上扩散的直径不超3mm。点样量应根据样品的性质及滤纸的长度来决定，一般点样量为5—30ug。溶剂前沿层析点原点3、平衡：点样好的滤纸卷成圆筒状用线缝好与盛有平衡剂的小烧杯，置于密闭的层析缸中，平衡1-2小时。4、扩展：将盛有约20ml左右扩展剂的培养皿迅速置于密闭的层析缸中，并将滤纸直立于培养皿中，密闭好层析缸。待溶剂上升到15—20cm时即取出滤纸，立即用铅笔描出溶济前沿，吹风机或烘箱干燥。图1-2滤纸缝合示意图5、显色：用喷雾器均匀喷上0.1%的茚三酮正丁醇溶液，干燥。6、计算：用铅笔描出各层析斑点的轮廓，并计算各氨基酸的Rf值。图谱显示图谱显示化学方法：显色剂不与滤纸起反应，挥发性小，易于去除，含水量少。物理方法微生物方法同位素和放射自显影法注意事项：1、要保证层析滤纸不被污染，特别是从点样线到溶剂前沿的部分。2、各氨基酸样品点样时量要均匀。3、在缝滤纸时，纸的两边不能接触。4、点样的一端朝下，扩展剂的液面需低于点样线1cm。六、实验结果六、实验结果样品aa标样Rf混合aaRf差值赖aa脯aa缬aa苯丙aa亮aa七、分析讨论七、分析讨论八、思考题八、思考题做好本实验的关键是什么？实验过程中，为何不能用手直接接触滤纸?影响Rf值的因素有哪些？