实验：细胞培养1.实验目的初步掌握哺乳动物细胞的原代培养与传代培养的基本操作过程，为生物工程在医学上的应用打下基础。2.实验原理从生物体中取出某种组织或细胞，模拟体内生理条件，在人工培养条件下使其生存、生长、繁殖或传代，这一过程称为细胞培养。细胞培养技术的最大优点是使我们得以直接观察活细胞，并在有控制的环境条件下进行实验，避免了体内实验时的许多复杂因素，还能够与体内实验互为补充，可同时提供大量生物性状相似的细胞作为研究对象，耗费少，比较经济，因此成为生物学研究的重要手段。近年来，在体细胞遗传、分化、胚胎发生、肿瘤发生、免疫学、细胞工程、放射生物学以及老年学等一系列的研究领域中得到广泛的应用，并获得了丰硕的成果。细胞培养可分为原代培养和传代(继代)培养。直接从体内获取的组织细胞进行初次培养为原代培养；当原代培养的细胞增殖达成一定密度后，则需要做再培养，即将培养的细胞分散后，从一种容器以1：2或其它比率转移到另一种或几个容器中扩大培养，为传代培养，传代培养的累积次数就是细胞的代数。细胞培养是一种程序复杂、规定条件多而严格的实验性工作。全部离体细胞的生长都受温度、渗入压、pH值、无机盐影响，消毒、配液等都有严格的规范和规定，特别是无菌操作是细胞培养成败的核心。3.实验用品3.1材料和标本乳兔、HeLa细胞(人宫颈癌细胞)3.2器材和仪器手术器械、平皿、培养瓶、吸管、离心管(灭菌后备用)、酒精灯、烧杯、超净工作台、二氧化碳培养箱、倒置显微镜。2.3试剂含有5％小牛血清的MEM培养液、0.01mol／LPBS，0.25％胰蛋白酶一0.02％EDTA混合消化液、75％乙醇。4.实验办法4.1原代细胞培养4.1.1原理细胞培养(Cellculture)是模拟机体内生理条件，将细胞从机体中取出，在人工条件下使其生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。近年来，广泛地应用于分子生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学、细胞工程等领域，发展成一种重要生物技术，并获得明显成就。由体内直接取出组织或细胞进行培养叫原代培养。原代培养细胞离体时间短，性状与体内相似，合用于研究。普通说来，幼稚状态的组织和细胞，如：动物的胚胎、幼仔的脏器等更容易进行原代培养。4.1.2操作①．取材用颈椎脱位法使乳兔快速死亡。然后，把整个动物浸入盛有75％乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超净台。用消过毒的剪刀剪开用碘酒和乙醇再次消毒后的皮肤，剖腹取出肝脏或肾脏。置于无菌平皿中。②．切割用灭菌的PBS液将取出的脏器清洗三次，然后用眼科手术剪刀认真将组织重复剪碎，直到成1mm3左右的小块，再用PBS清洗，洗到组织块发白为止。移入无菌离心管中，静置数分钟，使组织块自然沉淀到管底，弃去上清。③．消化、接种培养吸取0.25％胰蛋白酶一0.02％EDTA混合消化液1ml，加入离心管中，与组织块混匀后，加上管口塞子，37℃水浴中消化8～10分钟，每隔几分钟摇动一下试管，使组织与消化液充足接触，静止，吸去上清，向离心管中加入5～10ml含5％小牛血清的MEM培养基，用吸管吹打混匀，移入二个培养瓶中，置于二氧化碳培养箱中培养。4.1.3成果细胞接种后普通几小时内就能贴壁，并开始生长，如接种的细胞密度适宜，5天到一周即可形成单层。4.2传代细胞培养4.2.1原理体外培养的原代细胞或细胞株要在体外持续地培养就必须传代，方便获得稳定的细胞株或得到大量的同种细胞，并维持细胞种的延续。培养的细胞形成单层汇合后来，由于密度过大生存空间局限性而引发营养枯竭，将培养的细胞分散，从容器中取出，以1:2或l:3以上的比率转移到另外的容器中进行培养，即为传代培养。细胞“一代”指从细胞接种到分离再培养的一段期间，与细胞世代或倍增不同。在一代中，细胞培增3～6次。细胞传代后，普通通过三个阶段：游离期、指数增生期和停止期。惯用细胞分裂指数表达细胞增殖的旺盛程度，即细胞群的分裂相数／100个细胞。普通细胞分裂指数介于0.2％～0.5％，肿瘤细胞可达3～5％。细胞接种2～3天分裂增殖旺盛，是活力最佳时期，称指数增生期(对数生长久)，适宜进行多个实验。4.2.2操作①．将长成单层的原代培养细胞或HeLa...
