创作编号：GB88783BT9125XW创作者：凤呜大王*办法一：1.首先需要把细胞养在玻璃片上（悬浮细胞需要用多聚赖氨酸包被过的玻璃片）2.然后在4％PFA里面室温下固定30分钟，PBS洗两次，0.1%TX-100室温下作用1－2分钟使细胞膜通透。3.接下来进行荧光标记，需要在一种大的容器（面积大，扁平状的，例如大的培养皿）里面，放一张用水打湿的滤纸，以保持湿度。4.剪一片适宜大小的parafilm，在上面滴上稀释在1％BSA/TBS中的一抗（稀释倍数依具体抗体而定），每个玻璃片30ul足够，把玻璃片盖在上面（细胞面朝下），室温下孵育30分钟，然后在PBS里洗三次。5.接下来二抗孵育环节同上。6.最后，在载玻片加上mountingmedium（大概每个玻璃片加10ul），把玻璃片放上去（细胞面朝下），37度30分钟，然后就能够在荧光显微镜下观察了。7.抗体很重要，不能有非特异性结合。你能够先做WB检测一下你的抗体，看看有无杂带。8.双标的话，能够把两个一抗一起加或者分别标记两次（能够都试一下看看那种办法适宜）。如果一种抗体需要二抗，一种是直接荧光标记的，能够把荧光标记的那个和另外一种的二抗一起加。办法二：1.选用一抗时要来源于两种不同的动物，我用的是来源于rabbit和rat的抗体，二抗则是不同荧光信号标记的，我用的是donkeyanti-rabbit-FITC（绿）和donkeyanti-rat-Tex-Red（红）。2.我的做法是两种一抗同时孵育，然后两种二抗同时孵育。抗体浓度、孵育时间要认真探索，我感觉一抗4度孵育过夜比较好，背景比较清晰。3.我的阳性对照用的是阳性组织切片，阴性对照则分别是家兔和大鼠的IgG，荧光标记物对照是PBS+荧光标记物。4.封闭血清与二抗来源动物一致，我用的是10%的正常donkey血清。5.其它环节同普通免疫荧光单标操作。办法三：1.片子的制作：能够做细胞爬片，细胞甩片，尚有直接在24well/12well/96well中直接染色2.细胞爬片的制作：直接购置公司的已经解决过的细胞爬片，要是自己制作的话，就用无菌的盖玻片用多聚赖氨酸解决后让细胞自己爬片3.细胞甩片：需要甩片机将细胞悬液均匀甩到玻片上。4.其实小的well的话，能够直接拿来染色，没问题的。5.固定：用PBS洗去培养液，用固定液（如甲醇和丙酮；4%多聚甲醛；酒精。。。）固定细胞。6.内源性过氧化物酶解决，3%过氧化氢解决细胞（选作，二抗连HRP得必做，其它的如做免疫荧光染色不用做）。7.通透（胞浆蛋白和细胞核蛋白需要做；细胞膜蛋白不需要做），普通选用Triton-X100来做细胞通透，浓度和时间需要探索，普通是0.1-5%，解决时间为1-30分钟，级个别需要到1-2小时。8.封闭：洗去通透液，用二抗同源的血清约10%的浓度inPBS中封闭半小时，也能够选用5-10%脱脂奶粉。封闭结束后千万不要洗，直接上一抗。9.一抗：具体你想做什么样的蛋白，咨询抗体公司如santacruze,Abcam,sigma....。选用品体的抗体，但是一抗的稀释浓度也是要探索，抗体稀释液能够购置抗体公司现成的，对于新手还是挺好的。时间普通是4度过夜或者37度1小时。一抗最佳还是选用外国抗体公司的抗体。10.洗去一抗。11.上二抗，二抗普通抗体公司会给你推荐的，你在其中选上一种就行了，自己选国产的也行，就是选在哪个动物体内做的一抗，二抗就选抗那个动物的就行了。二抗的浓度也是需要探索的，抗体稀释液和一抗相似就行了。二抗的时间普通是37度半小时。12.底物显色（选作，二抗连得是酶的必做，按试剂盒的阐明书添加就行了，显色时间可能需要探索，以免显色过分引发假阳性；二抗连得是荧光报告的不用做）13.洗去二抗，染核14.DAPI或者Hoechst染核15.洗去染核液，加PBS，上镜观察。办法四：(1)细胞准备。对单层生长细胞，在传代培养时，将细胞接种到预先放置有解决过的盖玻片的培养皿中，待细胞靠近长成单层后取出盖玻片，PBS洗两次；对悬浮生长细胞，取对数生长细胞，用PBS离心洗涤(1000rpm，5min)2次，用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。(2)固定。根据需要选择适宜的固定剂固定细胞。固定完毕后的细胞可置于含叠氮纳的PBS中4℃保存3个月。PBS洗涤3×5min。(3)通透。使用交联剂(如多聚甲醛)固定后的细胞，普通需要在加入抗体孵育前，对细胞进行通透解决，以确保...
