1. HPLC 法测定大鼠血浆中的山奈酚1.1 目的要求1. 掌握血浆样品的前处理方法。2. 熟悉方法回收率和萃取回收率实验操作和评价。3. 熟悉大鼠眼眶采血技术；熟悉方法学研究中其他评价内容。1.2 主要实验材料与仪器山奈酚（Kaempferol）及其对照品，黄芩素（baicalein），抗坏血酸，肝素，β-葡萄糖醛酸苷酶（β-glucuronidase）和硫酸酯酶（sulfatase），分析纯甲醇，冰醋酸、无水乙醚，色谱纯乙腈；高效液相色谱仪，氮吹装置，恒温水浴，漩涡混合器，13000r/min 台式离心机，不同规格移液枪（5, 20, 50, 100, 200, 1000μL）和容量瓶（ 10 ， 25mL ） ， 5~10mL 具 塞 离 心 管 若 干 ； 雄 性 SD 大 鼠（180~220g）。 1.3 实验原理 山奈酚吸收进入体内后，多以二相代谢物葡萄糖醛酸苷和硫酸酯的形式存在。由于山奈酚葡萄糖醛酸苷和硫酸酯的对照品难以获得，故采用加入硫酸酯和葡醛酸苷水解酶处理样品，使代谢物水解后测定苷元山奈酚的浓度。实验以黄芩素为内标，HPLC 法测定血浆中山奈酚浓度，对建立的方法进行方法学评价。1.4 实验方法1.色谱条件：C18柱（250mm×4.6mm，5μm），配保护柱，柱温40℃；乙腈-0.5%冰醋酸（35:65）为流动相，流速 1mL/min；检测波长 370nm；进样量 20μL。2.溶液配制：取山奈酚对照品约 2.5mg，精密称定，置 25mL 量瓶中，用甲醇溶解并定容。精密吸取适量，分别用甲醇稀释成0.3、0.6、3、6、9、20 和 30μg/mL 的标准系列溶液，置 4℃冰箱保存。另取黄芩素适量，精密称定，用甲醇溶解并定量稀释至0.1mg/mL 的溶液，精密吸取 1.5mL 置 10mL 量瓶中，用甲醇定容，得内标溶液，置 4℃冰箱保存。3.血浆样品处理：取大鼠血浆样品 120μL，加入甲醇 20μL、1%冰醋酸（含 2mg/mL 抗坏血酸）32μL、β-葡萄糖醛酸苷酶（20U/mL）和硫酸酯酶（6U/mL）的混合水溶液 50μL，37℃水浴温育30min 后，加入内标溶液 50μL，然后加无水乙醚 2mL，漩涡混合5min，于 12000r/min 离心 5min；取上清液在氮气流下挥干，残留物用 100μL 甲醇复溶，12000r/min 离心 5min，取上清液进样分析。4.专属性考察：取空白血浆、添加山奈酚与内标的空白血浆、血浆样品，按“血浆样处理”项下方法处理，照“色谱条件”项下方法进样测定。比较所得色谱图，考察血浆内源性物质是否干扰测定，药物及内标是否达到基线分离。若有必要，适当调整色谱条件，已达到专属性要求。5.标准曲线制...
