如何减少和避免引物二聚体参照材料VIP专享VIP免费

内容作参考1 如何避免或减少引物二聚体汇总引物之间两个引物之间不应发生互补，特别是在引物 3’端，即使无法避免， 其 3’端互补碱基也不应大于2 个碱基，否则易生成引物二聚体Primer dimer。所谓引物二聚体实质上是在DNA 聚合酶作用下，一条引物在另一条引物序列上进行延伸所形成的与二条引物长度相近的双链DNA 的片段，是 PCR 常见的副产品， 有时甚至成为主要产物。形成引物二聚体原因1, 最根本的原因是引物之间或者自身存在互补序列。2，模板量过低 ; 3, 引物浓度多大 ; 4, 退火时间过长 . 可以通过下面的方法来减少引物二聚体：1. 适度减少引物的浓度（ 0.1－0.5pm）对于 30 轮放大足够2. 检查引物的自身结构，有无复杂的2 级结构和 FORWARD/REVERSE 之间的配对，尤其是 3'端互补结构3. PCR 反应体系的配制在冰上进行，最后加TAq 酶， PCR 结束后，产物勿放置在室温下过长时间，有认为室温下有些TAQ 酶会将多余的引物合成为二聚体。我试过，的确如此。4. 可以考虑加 DMSO,甘油， BSA 以及其他添加剂，解除引物二聚体。5. 如果 PCR 产物跑胶足够亮，可以考虑减少上样量，以及胶内显色物质（如减少 EB 的量）一般 PCR 体系的引物和ｄＮＴＰ的量是过量的，产物浓度不够可以适当增加模板量，而不是引物和ＮＴＰ。PCR 时，引物不要加太多，退火温度适当调高一点。减少 PCR 产物中引物二聚体的方法 : 1 从引物自身着手，重新设计引物，这是最根本解决这一问题的办法；2.可能模板有问题；模板浓度过小，适当加大模板量；3.Taq酶，引物， Mg2+浓度可能过高，可降低它们的浓度；内容作参考2 4.取你所要加的上下游引物混合后，在100 摄氏度下的沸水中煮5 分钟，然后迅速拿出至于冰块之上瞬时冷却， 这时再加入反应体系当中， 引物二聚体就会消失的；这点我试过 ,效果还不错5.所配 MIX 中加 5%的甘油或者 5%的 DMSO，可以增强特异性；6.PCR 反应体系的配制在冰上进行，最后加TAq 酶， PCR 结束后，产物勿放置在室温下过长时间， 有人认为室温下有些TAQ 酶会将多余的引物合成为二聚体。7.增加循环数；8.降低退火温度后有条带，则应逐渐提高温度，若提高温度的同时产物量减少，则考虑增加镁离子浓度 （根据扩增片断长度而定， 片段长则相应镁离子浓度应该高一些）；9.若降低退火温度，发现还是只有引物二聚体， 而且镁离子的浓度在20-25mmol/l没有区别，则考虑 Buffer 等试剂...