生化及分子生物学大实验VIP免费

实验 20 质粒 DNA 的提取与鉴定授课题目：质粒 DNA 的提取与鉴定（6 学时）授课对象：生科专业授课教师： 教学目标及基本要求：1、学习和掌握快速提取质粒 DNA 的原理和方法。2、学习和掌握质粒 DNA 的鉴定。3、采用开放性实验教学。教学内容提要及时间分配：1、实验原理讲解： 8 分钟碱变性法提取质粒 DNA 是基于染色体 DNA 与质粒 DNA 的变性和复性的差异而达到分离的目的。在 pH 值高达 12.6 的碱性环境中，染色体 DNA 的氢键断裂，双螺旋结构解开；质粒 DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条链不会完全分离。当用 pH 值 4.8 的KAc 或 NaAc 高盐缓冲液调节其 pH 值到中性时，变性的质粒 DNA 又恢复到原来的构型，保存在溶液中；而线状染色体 DNA 则不能复性，形成缠绕的网状物,通过离心，染色体 DNA 与不稳定的大分子 RNA、蛋白质-SDS 复合物一起沉淀下来而被除去，用乙醇或异丙醇将溶于上清液中的质粒 DNA 沉淀，再用 RNase 除去 RNA，即可获得较纯净的质粒 DNA。 2、实验试剂与器材 6 分钟溶液Ⅰ：50 mmol/L 葡萄糖，25 mmol/L Tris.Cl (pH8.0)，10mmol/L EDTA (pH8.0)。高压灭菌 15 分钟，储存于 4℃冰箱。溶液Ⅱ：0.2 mol/L NaOH（临用前用 10mol/L NaOH 母液稀释），1％ SDS（从 10% SDS母液中稀释，SDS 母液可室温保存），现配现用。 溶液Ⅲ：5 mol/L KAc 60mL，冰醋酸 11.5mL，H2O 28.5mL，高压灭菌，4℃冰箱保存。溶液终浓度为: K+ 3mol/L, Acˉ 5mol/L。3 mol/L 醋酸钠 (pH5.2)：800 mL 水中溶解 408.1g NaAc·3H2O，用冰醋酸调 pH 至5.2，加水定容至 100mL，分装后高压灭菌，储存于 4℃冰箱。STE 缓冲液：0.1mol/L NaCl，10mmol/L Tris·Cl(pH8.0)，1mmol/L EDTA (pH8.0)。TE 缓冲液：10 mmo/L Tris·Cl (pH8.0)，1 mmol/L EDTA (pH8.0)。高压灭菌后储存于4℃冰箱中。3、实验步骤讲解： 6 分钟将含有质粒 pGFPuv 的 DH5α 菌种划线接种在 LB 固体培养基（含有 100 μg/mL Amp）上，37℃培养 12-24 小时。用无菌牙签挑取单菌落接种到 5mL LB 液体培养基(含有 100 μg/mL Amp)中，37℃振荡培养 14~16 小时。取 1.5 mL 培养液加入 1.5 mL 离心管中，室温 12, 000 r/min 离心 1 分钟。加入 500 μL STE，涡旋打匀，室温 12, 000 r/min 离心 1 ...