DNA粗提取解读VIP免费

选用一定的物理或化学方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。对于DNA的粗提取而言．就是要利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。提取DNA的方法一、提取生物大分子的基本思路DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同。二、DNA的溶解性溶解度NaCl浓度0.14mol/L曲线解读：1、在NaCl溶液浓度低于0.14mol/L时，DNA的溶解度随NaCl溶液浓度的增加而逐渐降低；2、在0.14mol/L时，DNA溶解度最小；3、当NaCl溶液浓度继续增加时，DNA的溶解度又逐渐增大。利用该特点，选择适当的盐浓度就能使DNA充分溶解，而使杂质沉淀，或者相反，以达到分离的目的。DNA不溶于酒精，但细胞中某些蛋白质则溶于酒精。利用这一原理，可以将DNA与蛋白质进一步地分离。以鸡血为实验材料进行DNA的粗提取案例一：本实验用鸡血细胞做实验材料有两个原因：一是因为鸡血细胞核的DNA含量丰富，材料易得；二是鸡血细胞极易吸水胀破，而用动物肝脏细胞作实验材料常常需要匀浆和离心，对设备要求较高，操作繁琐，历时较长。为什么用鸡血细胞做实验材料？能否选用牛、羊、马血做实验材料？为什么？不能。因为哺乳动物成熟的红细胞中无细胞核，仅靠白细胞和淋巴细胞中的少数DNA，在实验中很难提取到。1、制备鸡血细胞液2、破碎细胞，释放DNA3、溶解细胞核内的DNA4、DNA的析出——提取5、DNA的初步纯化——提纯6、DNA的鉴定提取DNA的具体步骤1、制备鸡血细胞液取质量浓度为0.1g/mL的柠檬酸钠溶液100mL，置于500mL烧杯中，注入新鲜的鸡血（约180mL），同时用玻璃棒搅拌，使血液与柠檬酸钠溶液充分混合，以免血液凝结。将烧杯中的血液置于冰箱内，静置1d，使血细胞自行沉淀。用吸管除去上部的澄清液，就可以得到鸡血细胞液。柠檬酸钠可防止血液凝固2、破碎细胞，释放DNA向鸡血细胞液中加入蒸馏水，并且搅拌，从而使血细胞膜和核膜胀破。用玻璃棒搅拌可以加速细胞的破裂。注意应沿一个方向快速搅拌，但也不能太快太猛，防止打碎DNA。释放出来的大量DNA和RNA往往与蛋白质结合在一起，应用3～4层纱布进行过滤，除去一些颗粒较大的杂质。蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体，水分可以大量进入血细胞内，使血细胞胀裂，再加上搅拌的机械作用，就加速了鸡血细胞的破裂(细胞膜和核膜的破裂)，从而释放出DNA。此步骤获得的滤液中可能含有哪些细胞成分？可能含有核蛋白、多糖和RNA等杂质。3、溶解细胞核内的DNA在浓度较高的NaCl溶液中核蛋白容易解聚，游离出的DNA溶解在溶液中。在溶液中加入两倍体积的浓度为2mol/L的NaCl溶液，搅拌1min。注意应沿一个方向搅拌，使DNA充分溶解。如果使用植物材料，必须研磨充分。研磨不充分会使细胞核内的DNA释放不完全，提取的DNA量变少，影响实验结果，导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等。4、DNA的析出——提取将溶液中的DNA与其他杂质分离，这一步骤是实验成败的关键。加蒸馏水降低NaCl溶液浓度，使DNA析出。实验中应该缓慢贴壁加入蒸馏水，并轻轻地沿一个方向不停地均匀搅拌，以利于DNA分子的附着和缠绕。同时应注意控制加水量，使NaCl溶液的始终浓度为0.1～0.2mol/L。加水太多、溶液过稀，会使DNA分子又重新溶解。为什么反复地溶解与析出DNA，能够去除杂质？1、用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐中不能溶解的杂质；2、用低盐浓度使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质。5、DNA的初步纯化——提纯如果提取的DNA量不够多且其中含有较多杂质，或者加入溶液和搅拌等操作过程不规范，都会导致实验现象不明显，常常使制取的DNA粗制品不能显示出DNA的本色──白色。为了增进实验效果，需要对DNA粗制品进行简单的提纯。6、DNA的鉴定二苯胺法：紫外灯照射法：用蒸馏水配制质量分数为0.05%的溴化乙锭(EB)溶液，将玻璃棒上缠绕的白色絮状物抹到蜡纸上，再滴1滴EB溶液染色。将蜡纸放在紫外灯(260nm)下照射(暗室中)，可呈现橙红色的萤光(DNA的紫外吸收高峰在260nm处)。电泳法：适合鉴定纯度较高的DNA。DNA与二苯胺沸水浴呈现蓝色。鉴定时溶液蓝色...