PCR的来源及发展解析VIP免费

医学分子生物学PCR(PCR(PolymeraseChainReactionPolymeraseChainReaction))泸医附院检验科分子实验室：李宝林PCR什么是PCR？聚合酶式反应（polymerasechainreaction，简称PCR），又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促反应扩增技术。PCR的用途扩增各种蛋白的基因：用于基因重组、蛋白表达、构建cDNA文库PCR后的测序：可以很快地测出常规的PCR产物或单链的DNA序列用于分子进化和种系发育的研究，因为在一些巨大分子的序列中含有足够的进化信息，通过PCR对其编码基因的扩增，并与较近或较远的种系比较，研究其分子进化及种系发育是很有用的分析和诊断遗传性疾病，根据其基因的缺失或突变对其做出诊断。如甲型血友病、苯丙酮酸尿症、地中海贫血等有特定的遗传性基因，可以做出明确的诊断对人类HLA基因的多肽性分析，用于器官移植的配型。比原有的免疫学方法要好得多，无论在准确性及特异性，检测的速度等方面都提高了许多PCR技术的发展史第一代：手动/机械手式水浴箱基因扩增三个水浴箱恒定三个温度，94°58°72°优点：设备简单，投资少，与自动扩增仪相比无需升降温过程，实验时间短，更接近理想PCR反应条件缺点：实验人员劳动强度大，易疲劳而出差错，标本在移动过程中会暴露在空气下，温度受影响。而且有的地方由于气压水温无法达到94°第二代：自动化控制型定性基因扩增仪与第一代水浴式扩增仪相比，也有人称该种扩增仪为干式基因扩增仪，它是最具代表性的扩增仪，包括后续介绍的第三代、第四代都是以第二代为基础集成了定量检测部分无法对初始模板精确定量无法实时监测扩增情况跑胶繁琐，易污染PCR技术的发展史PCR技术的发展史第三代：终点定量/半定量第二代的定性PCR只能判断阴性阳性，而无法评价特定核酸的浓度及定量分析，定量PCR至少能达到定性PCR无法实现的下列功能：潜伏期病毒浓度探测感染程度致病病原体数量变化测定抗病毒药物疗效评估恢复期病毒载量检测PCR技术的发展史第四代：实时定量PCR实时定量QPCR仪＋实时荧光定量试剂+通用电脑+自动分析软件，构成PCR-DNA/RNA实时荧光定量检测系统。PCRPCR的基本原理的基本原理PCRPCR由变性由变性----退火退火----延伸三个基本反应步骤构成：延伸三个基本反应步骤构成：模板模板DNADNA的变性：模板的变性：模板DNADNA经加热至经加热至94℃94℃左右一定时间后，使模左右一定时间后，使模板板DNADNA双链或经双链或经PCRPCR扩增形成的双链扩增形成的双链DNADNA解离，使之成为单链，以解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备便它与引物结合，为下轮反应作准备模板模板DNADNA与引物的退火（复性）：模板与引物的退火（复性）：模板DNADNA经加热变性成单链后，经加热变性成单链后，温度降至温度降至55℃55℃左右，引物与模板左右，引物与模板DNADNA单链的互补序列配对结合单链的互补序列配对结合引物的延伸：引物的延伸：DNADNA模板模板----引物结合物在引物结合物在72℃72℃、、DNADNA聚合酶（如聚合酶（如TaTaqDNAqDNA聚合酶）的作用下，以聚合酶）的作用下，以dNTPdNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNADNA链互补的半链互补的半保留复制链保留复制链待扩增片段待扩增片段高温变性高温变性低温退火低温退火中温延伸中温延伸PCR结果的分析thankyou