第23章病毒感染的实验室诊断技术2第一节标本的采集、处理与运送第二节病毒形态学检查第三节病毒的分离与鉴定第四节病毒的血清学检测第五节病毒的分子生物学检测第六节病毒感染的快速诊断主要内容THEEND3一、标本的采集、处理第一节标本的采集、处理与运送（一）采集样本的时间在发病初期（急性期）采取较易检出病毒，越迟阳性率越低。（二）标本种类的选择1.呼吸道感染2.肠道感染3.中枢神经系统感染4.其他感染41．血液2．粪便标本3．尿道拭子及尿液标本4．鼻拭子和咽拭子5．喉拭子6．含漱液标本（三）常见标本的采集方法和用途7．脑脊液标本8．眼拭子标本9．宫颈或阴道拭子10．疱疹液标本11．各种活检和尸检标本51．血液标本2．粪便标本3．鼻、咽拭子标本4．尿标本5．疱疹液6．脑脊液7．组织标本（四）标本的处理6病毒的抵抗力通常较弱，在室温下很快灭活，标本采集后应立即送到病毒实验室，如实验室距离较远或一时无法立即传送时，应将标本放入装有冰块的冰壶内尽快送检。大多数病毒对甘油有抵抗力，送检的组织、粪便标本等可置于含抗生素的50%甘油缓冲盐水中，低温下保存送检。最好在标本采取后1~2h内送到实验室，立即进行检查或分离培养。暂时不能检查或分离培养时，应将标本放入冻存液并加入甘油或二甲基亚砜（DMSO）以防止反复冻溶使病毒灭活，存放在-70℃低温冰箱内保存。二、标本的运送和保存7一、形态学检查（一）光学显微镜（二）电子显微镜检查法1、电镜直接检查法2、免疫电镜检查法（三）X线晶体衍射法第二节病毒形态学检查8（一）电子显微镜直接测量（二）超过滤法（三）超速离心法二、病毒大小的测定9一、病毒分离和鉴定的一般程序第三节病毒的分离与鉴定临床标本的收集标本处理后接种新生小鼠组织鸡胚收获尿囊液、羊膜腔液红细胞凝集试验CPE红细胞吸附空斑试验包涵体EM观察发病10（一）病毒分离培养1．动物接种二、病毒的分离与鉴定2．鸡胚培养113．组织培养（1）原代和次代细胞培养（2）二倍体细胞培养（3）传代细胞培养（4）病毒在培养细胞中增殖的指标1）细胞病变2）红细胞吸附（hemadsorption）3）干扰现象4）细胞代谢的改变12（二）病毒的数量与感染性测定1．蚀斑（plaque）测定蚀斑形成单位（plaqueformingunit,PFU）2．50%感染量或50%组织感染量（ID50或TCID50）测定（三）新分离病毒的鉴定1．病毒核酸类型的测定2．理化性状的检测：大小及结构、衣壳对称类型、有无包膜等3．血清学鉴定13一、中和试验（一）原理（二）用途第四节病毒的血清学检测二、补体结合试验（一）原理（二）用途14三、血凝及血凝抑制试验（一）原理（二）用途四、凝胶免疫扩散试验（一）原理（二）用途15一、分子杂交技术（一）基本原理（二）主要步骤样品处理、探针的制备、预杂交、杂交、漂洗、检测（三）常用的杂交方法1．斑点杂交(spotb1othybridization)2．固相杂交技术3．原位分子杂交（insitehybridization）4．Southern印迹和Northern印迹法5．分支DNA（branchedDNA,bDNA）技术第五节病毒的分子生物学检测16二、聚合酶链反应（polymerasechainreaction,PCR）（一）基本原理（二）主要步骤1.模板的制备2.反应体系的组成：缓冲液、dNTPs、引物、TaqDNA聚合酶、模板3．扩增：变性→复性→延伸4．产物分析（三）常用技术巢式（nested）和半巢式（hemi-nested）PCR、原位PCR（sitePCR）、逆转录PCR（reveretranscriptivePCR,RT-PCR）、多重PCR（multiplePCR）、RNA捕获PCR(RNAcapturedPCR)、免疫PCR（immunePCR）、定量PCR（rationPCR）17三、凝胶电泳技术（一）基本原理（二）常用方法1．琼脂糖凝胶电泳2．聚丙烯酰胺凝胶电泳18一、形态学检查二、病毒抗原的检测（一）免疫荧光技术（二）固相放射免疫测定（三）酶免疫技术（四）其他技术三、早期抗体检测四、病毒核酸检测第6节病毒感染的快速诊断19
