北京康为世纪生物科技有限公司BeijingCoWinBiotechCo.,Ltd.康为世纪原核表达及纯化蛋白表达流程•序列分析•表构建达载体•蛋白表达•蛋白纯化•蛋白检测原核表达•非融合型表达载体•融合型表达载体--带标签的表达载体（His、GST）具有编码不同多肽的标签序列，为定位、检测或纯化目的蛋白提供方便。若蛋白较小可加入融合标签，促进蛋白正确折叠。--分泌型表达载体可使外源基因产物直接分泌到大肠杆菌的外周腔，减少在胞内表达且表达产物对细菌的毒性，同时外周腔中的蛋白酶活性低，有助于提高融合蛋白的稳定性。原核生物表达系统优势：遗传背景清楚、表达量高、产物易纯化、使用范围广。劣势：原核表达系统翻译后修饰体系不完善，表达产物活性低。优势：遗传背景清楚、表达量高、产物易纯化、使用范围广。劣势：原核表达系统翻译后修饰体系不完善，表达产物活性低。原核表达•目的基因的获取•选择载体、构建重组表达质粒•转化受体菌•重组体的筛选鉴定I重组表达载体克隆1.目的基因获取：基因组DNA、mRNA反转录cDNA、人工合成2.常用载体：His标签：pET系列（pET28a、pET32a）、pQE系列GST标签：pGEX系列3.构建重组质粒：选择合适的内切酶位点、酶切、连接4.转化感受态细胞：热击法转化非表达型感受态菌5.重组体的鉴定：阳性抗药克隆菌落PCR阳性抗药克隆提质粒、酶切鉴定测序原核表达•转化表达菌株•优化诱导条件•表达蛋白检测•放大培养II蛋白诱导表达1.表达菌株选择：（pET系统）常规表达菌株：BL21表达毒性蛋白：BL21pLys适合表达真核基因：Rosseta（BL21衍生菌，补充大肠杆菌缺少的6种稀有密码子）2.诱导表达pET系统采用T7启动子，诱导剂：IPTG诱导要素：IPTG浓度、诱导温度、诱导时间设置阴性对照：未加IPTG诱导3.SDS-PAGE、WB检测，确定目的蛋白未诱导、诱导后的全菌、诱导后上清、诱导后沉淀包涵体表达及增加蛋白可溶性优化诱导条件，增加蛋白溶解性在E.coli中表达的重组蛋白经常以不溶的、无活性蛋白聚集体的形式表达，被称作包涵体。即使在形成包涵体时，还是有一部分目的蛋白是溶解的。由于pET系统的高表达水平，即使有大量的目的蛋白聚集形成包涵体，也会有相当多的可溶性目的蛋白存在。在通常情况下，降低蛋白合成速率，如降低诱导培养温度及在基本培养基中生长都会使目的蛋白的可溶性增加。诱导和培养条件：37℃（包涵体），30℃，低温(15-20℃)诱导过夜，IPTG浓度，诱导后的培养条件细胞周质定位：选择带有信号肽的载体（pET12/20/22）宿主菌：尝试可表达真核蛋白的Rosseta菌株裂解缓冲液：普通的Bindingbuffer中一些疏水或膜结构蛋白会是不溶的，但如果加入非离子去污剂就会变成可溶。表达载体选择标签选择：6XHis：--适合任何表达系统--纯化后不需切割标签--纯化简单，也可纯化包涵体蛋白--小标签对重组蛋白折叠影响小GST：谷胱甘肽巯基转移酶--适合任何表达系统--相对可增加蛋白的可溶性--纯化后需切除标签--标签蛋白可能会形成二聚体标签蛋白：优点--可以提高蛋白的可溶性和稳定性。--用亲和层析的方法对蛋白进行纯化，采用通用的检测标签的方法。缺点--标签可能对蛋白的结构、折叠和生物学活性有影响。--切除标签时，酶切效率不会达到100%，会有氨基酸残余。His标签：pET系列•常规表达载体：pET28a、pET32a、pQE系列•周质腔表达载体：CBD融合(pET36/37)、Dsb融合(pET39/40)采用带pelB/ompT引导肽的载体(pET12/20/22)采用带MBD融合(pMAL载体,Biolabs)、SUMO融合GST标签：pGEX系列pET-28a蛋白纯化•蛋白纯化方法--亲和层析--凝胶过滤--离子交换层析亲和层析—通过生物分子之间特异性的相互作用来分离物质的方法。配体—受体抗原—抗体底物—酶常用的亲和配基配基目标蛋白洗脱条件其他Ni2+组氨酸标签(His)咪唑载体：pET谷胱甘肽谷胱甘肽巯基转移酶(GST)还原型谷胱甘肽载体:pGEX直链淀粉麦芽糖结合蛋白（MBP）麦芽糖载体：pMAL，具有MBP信号序列进行分泌表达，改善溶解性proteinA/G不同哺乳动物的IgGFc段低ph值，甘氨酸从血清或者腹水中纯化总IgG蛋白纯化主要步骤•样品准备•缓冲液准备--结合缓冲液--洗脱缓冲液•组装层析柱•纯化•检测定量CW000...
